基于免疫组织化学法分析基质金属蛋白酶2在喉鳞状细胞癌中表达及意义的Meta分析△

黄强　周梁

喉癌是耳鼻喉科常见的恶性肿瘤之一，且随着生活环境以及生活方式的改变，发病率有逐年上升趋势[1]，也是唯一一个5年生存率不升反降的肿瘤类型[2]。吸烟、饮酒的人群罹患喉癌的风险比不吸烟、不饮酒的人群高数倍[3]。喉癌早期症状隐匿，发现时60%的患者已进入进展期[1]，故早期诊断和治疗喉癌是临床的重中之重。相关研究[4]表明：基质金属蛋白酶2(metal matrix proteinase-2, MMP-2)介导喉癌细胞的间质迁移以及浸润、转移等恶性生物学行为，在喉癌的发生、发展中具有重要的作用。本研究系统评价MMP-2在喉癌中的表达及其临床意义，以期能给基础和临床研究提供证据支撑。

1　资料与方法

1.1检索策略通过中国知网(CNKI)、万方、维普、Pubmed、Web of science等国内外数据库以“基质金属蛋白酶2(MMP-2)、明胶酶2(matrix metalloproteinase-2)、喉癌(laryngeal carcinoma)、喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)、喉肿瘤(laryngeal cancer)”等检索词进行计算机检索，收集关于MMP-2在喉癌中表达及其意义的文献，时间跨度为建库后到2017年1月，辅以手工检索参考文献。

1.2纳入标准①国内外公开发表的关于MMP-2在喉癌中表达情况的病例-对照研究；②肿瘤组标本必须经病理验证为LSCC，对照组标本为非肿瘤组织，包括正常黏膜、声带息肉以及癌旁安全缘组织；③所有喉癌患者之前未接受任何放、化疗以及生物治疗等措施；④检测方法为免疫组织化学SP(streptavidin-perosidase)法；⑤原始文献中可提取出优势比(odd ratio,OR)值和95%可信区间(confidence interval,CI)，或者可通过推导得出。

1.3排除标准①无对照组或者对照组为癌前病变样本；②样本含非LSCC以及喉转移癌；③Western印迹等其他检测方法或非免疫组织化学SP法；④无免疫组织化学结果评判标准；⑤综述、会议论文等文献；⑥推导不出数据以及数据信息过少的文献；⑦重复发表的文献。

1.4筛选、质量评价、数据提取由2名研究者根据检索策略以及纳入、排除标准独立进行文献检索，根据Lichtenstein质量评价表[5]进行质量评价。①是否明确纳入标准及其基本特征；②是否科学地设计试验；③是否正确处理相关因素及方法；④是否正确使用统计方法；⑤是否就存在的偏倚进行讨论。以上5项指标，每项为1分，满足总分≥3分者认为文献质量可靠。进行数据提取、整理。主要指标为MMP-2在肿瘤组织以及对照组中的表达差异，次要指标包括MMP-2在喉癌不同临床分期、TNM分期、病理分级、原发位置以及淋巴结是否转移之间的差异。有分歧时由2名研究者

通过讨论解决问题，意见不一致的由第三方评定。

1.5统计学处理采用从Cochrane协作网下载的Review manager 5.3软件按照Meta分析的要求对结局指标进行合并分析并绘制出森林图，采用OR值及95%CI为分析统计量，检验水平为P=0.05。25%≤I2<50%为存在轻度异质性，50%≤I2<75%为存在中度异质性，I2≥75%为存在重度异质性。各研究结果间存在异质性差异时(P≤0.10，I2≥25%)采用随机效应模型，无异质性差异时则采用固定效应模型(P>0.10，I2<25%)。

2　结果

2.1文献检索结果联机以及手工检索共获得相关文献122篇，根据文献的纳入、排除标准，阅读摘要排除内容不相关文献80篇，重复发表或综述6篇，阅读全文排除无对照组或对照组不符要求11篇，样本含非LSCC及喉转移癌3篇，非免疫组织化学SP法检测13篇。共纳入符合标准的文献9篇[6-14]，其中LSCC组样本共473例，对照组样本共245例(图1)。

图1.　文献筛选流程图

2.2入选文献的基本特征纳入研究的9篇文献质量都较高，包含了LSCC组与对照组MMP-2表达水平的比较以及MMP-2在LSCC淋巴结是否转移之间的原始数据；5篇涉及MMP-2在LSCC不同临床分期之间的差异比较；4篇涉及MMP-2在LSCC不同TNM分期中的变化；7篇涉及MMP-2在LSCC不同病理分级表达情况的比较；3篇涉及MMP-2在LSCC不同原发位置的表达差异。文献质量评价详情、基本特征见表1、2。

表1　Lichtenstein质量评价表

表2　纳入研究的基本特征(MMP-2表达阳性率)

注：“/”表示无此项

2.3MMP-2表达结果分析

2.3.1MMP-2在LSCC组与对照组中的表达有关MMP-2在LSCC组和对照组中的研究共纳入9篇文献，其中LSCC组中MMP-2表达阳性者359例(75.90%)，对照组中MMP-2表达阳性者67例(27.35%)。各项研究间存在中度异质性(P=0.03，I2=54%)，因此选用随机效应模型进行分析。结果显示：LSCC组和对照组在MMP-2表达水平上的差异具有明显统计学意义[OR=8.88，95%CI：5.04～15.63，P<0.05](图2)。

图2.　MMP-2在LSCC组与对照组中的表达情况

2.3.2MMP-2在LSCC不同临床分期中的表达关于MMP-2在LSCC不同临床分期中的研究共纳入5篇文献，其中Ⅰ～Ⅱ期MMP-2表达阳性者56例(68.29%)，Ⅲ～Ⅳ期MMP-2表达阳性者111例(85.38%)。各项研究之间不存在异质性(P=0.50，I2=0)，据此选用固定效应模型进行分析。结果显示：LSCC不同临床分期中MMP-2的表达水平差异具有明显统计学意义[OR=2.76，95%CI：1.39～5.51，P<0.05](图3)。

图3.　MMP-2在LSCC不同临床分期中的表达情况

2.3.3MMP-2在LSCC不同TNM分期中的表达关于MMP-2在LSCC不同TNM分期中的研究共纳入4篇文献，其中T1～T2期MMP-2表达阳性者52例(61.90%)，T3～T4期MMP-2表达阳性者95例(83.33%)。各项研究之间不存在异质性(P=0.45，I2=0)，据此选用固定效应模型进行分析。结果显示：LSCC不同TNM分期中MMP-2的表达水平差异具有明显统计学意义[OR=3.46，95%CI：1.72～6.96，P<0.05](图4)。

图4.　MMP-2在LSCC不同TNM分期中的表达情况

2.3.4MMP-2在LSCC有无淋巴结转移中的表达关于MMP-2在LSCC有无淋巴结转移中的研究共纳入9篇文献，其中淋巴结有转移组MMP-2表达阳性者190例(87.16%)，淋巴结无转移组MMP-2表达阳性者169例(66.27%)。各项研究之间存在中度异质性(P=0.007，I2=62%)，因此选用随机效应模型进行分析。结果显示：MMP-2在LSCC淋巴结有无转移的表达水平上差异具有明显统计学意义[OR=4.07，95%CI：1.60～10.32，P<0.05](图5)。

图5.　MMP-2在LSCC有无淋巴结转移中的表达情况

2.3.5MMP-2在LSCC不同病理分级中的表达关于MMP-2在LSCC不同病理分级中的研究共纳入7篇文献，其中中低分化组MMP-2表达阳性者189例(83.26%)，高分化组MMP-2表达阳性者87例(64.93%)。各项研究之间存在轻度异质性(P=0.08，I2=46%)，因此选用随机效应模型进行分析。结果显示：MMP-2在LSCC不同病理分级的表达水平上的差异具有统计学意义[OR=3.04，95%CI：1.35～6.85，P<0.05](图6)。

图6.　MMP-2在LSCC不同病理分级中的表达情况

2.3.6MMP-2在LSCC不同原发位置中的表达关于MMP-2在LSCC不同原发位置中的研究共纳入3篇文献，其中声门型组MMP-2表达阳性者68例(74.73%)，非声门型组MMP-2表达阳性者54例(72.97%)。各项研究之间存在中度异质性(P=0.14，I2=50%)，因此选用随机效应模型进行分析。结果显示：MMP-2在LSCC不同原发位置的表达水平上的差异并不具有明显统计学意义[OR=1.10，95%CI：0.38～3.13，P=0.86](图7)。

图7.　MMP-2在LSCC不同原发位置中的表达情况

2.4发表偏倚通过绘制倒漏斗图(图8)发现所有研究呈倒漏斗状排列，但并不完全对称分布。不能排除存在发表偏倚的可能，需进一步做敏感度分析以验证结论是否稳健。

图8.　LSCC组和对照组MMP-2表达差异的倒漏斗图

2.5敏感度分析本文研究的主要指标是MMP-2在LSCC组和对照组的表达情况，次要指标是MMP-2在LSCC淋巴结是否转移以及不同病理分级中的表达情况，均有不同程度的异质性差异，因此有必要进行敏感度分析以检验这3项指标的结论是否受异质性差异的影响。通过逐篇剔除纳入的文献，发现这3项指标的结论并没有发生改变，差异仍然具有统计学意义[OR=8.88，95%CI：5.04～15.63，P<0.05；OR=4.07，95%CI:1.60～10.32，P<0.05；OR=3.04，95%CI:1.35～6.85，P<0.05]。同时通过Stata 13.1软件进行敏感度分析验证，结果显示：纳入的效应值基本上在总效应值的可信区间之内(图9～11)，提示异质性差异的存在并没有影响这3项指标结论的稳定性，结果较稳健。

图9.　MMP-2在LSCC组和对照组表达差异的敏感度分析

图10.　MMP-2在LSCC淋巴结是否转移中表达差异的敏感度分析

图11.　MMP-2在不同病理分级中表达差异的敏感度分析

3　讨论

Meta分析是整合分析众多具有特定条件研究的一种方法，通过Meta分析可以将众多小样本研究整合在一起，达到扩大样本含量增强检验效能的目的，因此在临床研究和医疗决策中扮演重要的角色。本研究利用Meta分析研究MMP-2在LSCC中的表达及其临床意义，为了验证结论是否稳健以及是否受到发表偏倚等影响，通过倒漏斗图绘制验证，逐篇剔除纳入文献以及利用Stata 13.1软件进行敏感度验证，均提示即使纳入的相关文献存在一定的异质性以及发表偏倚，但结论仍然具有统计学意义，结果可靠。但是受到阴性结果不发表、文献语种限制、样本量、实验方法和纳入文献条件限制等问题，不可避免地存在各种偏倚，在一定程度上也会影响Meta分析的结果，因此尚需增加样本量及优化方案以进一步验证。

浸润、转移是恶性肿瘤区别于良性病变的最显著特征，亦是造成临床治疗失败的主要原因之一。MMPs超家族是一组高度同源的蛋白酶类，主要包括MMP-2和MMP-9，参与降解、破坏构成细胞外基质的Ⅳ型胶原，而Ⅳ型胶原则是构成基底膜的重要组成成分[15]。MMPs超家族(包括MMP-2和MMP-9)以酶原形式分泌，在生理条件下参与胚胎发育、组织重塑等过程，但在某些病理条件下被金属蛋白酶组织抑制因子2(TIMP-2)招募到细胞表面激活而参与炎症以及肿瘤转移的过程[16]。基底膜是提供细胞结构支撑、营养等的重要结构，也是阻止肿瘤细胞转移的重要屏障，其病理性的降解可导致肿瘤细胞沿着基底膜缺口向间质迁移、促进肿瘤细胞从原发部位脱落向远处转移[17]，因此与肿瘤的发生、发展关系密切。最近有研究[18]发现：胆管癌细胞可通过下调miR-138的表达水平增强MMP-2和MMP-9的表达，从而使其增殖迁移以及侵袭能力得到加强。而在人骨肉瘤细胞中，肿瘤细胞产生的结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)通过下调miR-519d的表达水平增强了MMP的表达，从而促进了肿瘤的转移[19]。Xu等[20]采用葡萄糖转运体-1(glucose transporter protein-1, Glut-1)反义核酸技术转染LSCC细胞系Hep-2，发现与肿瘤恶性行为密切相关的Glut-1与MMP-2共表达，且Glut-1参与调控MMP-2的表达。这提示在肿瘤的浸润和转移过程中，调控MMP表达水平的基因及机制极为复杂，共同参与了对细胞外基质的降解，从而促进了肿瘤细胞的生长和侵袭能力。

本研究通过Meta分析发现MMP-2的表达在LSCC组织中增加。林雁等[10]分析了MMP-2在54例肿瘤组织、23例声带息肉组织和15例喉部正常组织的表达水平，发现MMP-2的表达在肿瘤组织的表达水平(72.2%)高于息肉组织(47.8%)和喉部正常组织(40%)，推测MMP-2的表达与临床分期、病理分级及淋巴结转移和浸润深度存在相关性。这与Gou等[21]发现MMP-2在LSCC组织中高表达，且MMP-2的高表达水平是导致LSCC患者预后较差的因素结果一致。另外本研究结果发现MMP-2表达水平在临床分期、TNM分期、淋巴结转移、病理分化等方面具有紧密的相关性，均提示MMP-2在LSCC的发生、发展、演化中具有重要意义。而MMP-2在LSCC不同原发部位差异并不显著的原因，推测可能是由于不同原发部位的肿瘤产生MMP-2的量无显著差别所致

总之，本研究采用Meta分析发现MMP-2在LSCC组织中的表达增高，且与肿瘤进展、淋巴结转移、病理分化存在相关性。MMP-2的表达水平改变可能在LSCC的早期诊断和治疗等方面具有重要意义。随着MMP-2的致癌机制以及在LSCC浸润、转移、预后中具体作用的深入研究，特异性地抑制MMP-2也可能成为一种潜在的LSCC靶向治疗策略。

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