无特定病原体麻鸭种群的建立*

2018-03-31韩凌霞赵丽丽于海波张圆圆陈洪岩

实验动物科学 2018年2期

韩凌霞赵丽丽于海波张伟张圆圆陈洪岩

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物与比较医学团队/国家禽类实验动物种子中心，哈尔滨 150001)

开发具有重大价值的实验动物资源，特别是农用实验动物资源，是实验动物科学研究的重要内容。目前我国虽已基本除鸡实现实验动物化而得到广泛应用外，尚无其它禽类动物实验动物化，这对丰富实验动物资源，尤其是动物疫病研究，以及诊断试剂、疫苗研发非常不利。我国是世界最大的鸭生产国，鸭肉、鸭蛋和羽绒产量均位居世界第一。全国肉鸭存栏已达12亿只，肉鸭出栏约38亿只，鸭肉、鸭绒初级产品的年总产值已经达到790亿元，鸭蛋总产值约430亿元。鸭还是多种禽病和部分人类疫病疫苗的生产原材料和检定材料。本文是目前国内有关无特定病原体(SPF)种鸭群的专业报道。疫病对我国水禽养殖业危害严重，因此，培育SPF鸭，实现禽病研究和生物制品材料的标准化，对于动物健康养殖非常必要。

1 引种

绍兴麻鸭白壳I号产蛋性能优良，适应性强，可在寒冷干燥地区离地饲养和笼养，适合于实验动物化；金定鸭是我国著名的蛋鸭地方品种，具有产蛋量高、体型小、饲料利用率高、杂交利用效果明显、适应性强等优点[1-2]。国家禽类实验动物种子中心在2005年引进了浙江省农业科学院畜牧兽医研究所培育的绍兴麻鸭高产系白壳I号祖代鸭种卵，在国内率先开始培育SPF鸭群，2015年从国家水禽种质资源基因库江苏省丰达水禽育种场引进祖代金定鸭种卵，丰富SPF鸭群遗传资源。

种卵在正压5级屏障环境内的孵化器和出雏器内孵化、出雏，在鸭用正压隔离器内饲养。开始SPF鸭群的培育。

2 质量控制

2.1 制定饲养管理制度、规程

结合鸭的生产特点，制订了详细的环境设施、设备运行、养护、检测、验证程序，严格控制环境设施指标；对人流、物流、气流、饲喂、孵化等环节制定了严格的日常消毒、管理和生产工艺规程，规定了详细的三次更衣、换鞋、手消毒、种蛋熏蒸、物料无菌传递、动物饮用水与清洁水无菌处理及检测、消毒剂验证等操作流程，阻断各种可能的水平传播途径。

严格控制环境设施指标，实时维护、实时监测、定期检测、定期验证、积极评价及纠偏。特别注意设施设备的气密性维护，各种出入口的控制，进入设施设备人员、物品、鸭卵、饲料、清洁水、动物应用水的去菌、消毒。注意降温、降尘。注意动物及物品传递。阻断外界环境污染和再感染途径，保证孵化环境达到正压7级，饲养环境达到正压5级。

2.2 选育培育

以母系为单位组成家系，采用循环雄鸭的杂交方式培育封闭群。对各世代种鸭进行体增重、受精率、孵化率、产蛋率、等性能指标测定，选出性能好的家系组成种鸭基础群(不少于800羽，连续3代以上)。

2.3 微生物质量控制

按照世界兽医组织(OIE)的公布，有26种病原可感染鸭，新西兰出口鸭种卵规定检测9种病原，澳大利亚检测8种病原。我国报道的主要疫病有鸭瘟、鸭病毒性肝炎、番鸭细小病毒病、鸭禽流感、番鸭“花肝病”、鸭大肠杆菌病、鸭副伤寒、鸭出败、鸭疫里默氏杆菌病等。参照国外进出口鸭及鸭卵检验检疫技术，结合我国国情制定了SPF鸭微生物学监测技术规范，建立了番鸭细小病毒[3]、I型鸭肝炎病毒[4]、多杀性巴氏杆菌[5]、鸭疫里氏杆菌[6]、产肠毒素大肠杆菌[7]等多种疫病的检测技术，确定了SPF鸭微生物学监测的病原微生物项目、检测方法和检测程序，制定了中国实验动物学会团体标准《实验动物 SPF鸭微生物学监测总则》T/CALAS 18—2017。

针对严重影响实验鸭的多种病原微生物，利用病原微生物分离，血清学抗原、抗体检测，以及分子生物学等手段，对绍兴麻鸭(定名为HBK鸭)、金定鸭(定名为JD鸭)定期全群监测。要求在鸭群的一生中至少每周要做一次临床观察，以确保鸭没有任何感染的症状，首次监测从8周～10周龄开始。常规监测，每隔4周，抽样检测规定的所有项目。未开产鸭，对所有饲养单元进行全部检测;在整个产蛋期对全部因子进行抗原或抗体检测;在产蛋后期，监测是否存在垂直传播疾病。

2.3.1疫苗免疫:对种鸭免疫鸭病毒性肝炎I型灭活苗，对F1代雏鸭免疫2次禽流感H5/H9二联灭活苗，对F2代雏鸭免疫鸭疫里默氏杆菌/大肠杆菌二联灭活苗。

2.3.2临床监测和隔离淘汰:制订临床症状观察项目表，用于饲养人员随时记录鸭群的异常临床症状。采用“看”、“听”和“闻”等感官观察，要求饲养人员随时对鸭群和个体的精神状态、采食量、粪便颜色等12项指标进行监测，及时取出可疑动物并送交检测室剖检。

2.3.3净化:鸭病毒性肠炎和鸭病毒性肝炎是鸭最常见、危害较大的两种病毒性疾病。绍兴麻鸭种蛋引进之前，曾对种母鸭免疫了鸭病毒性肝炎I型灭活苗和鸭瘟冻干苗。种蛋孵出后，先连续对F1代和F2代进行血清学监测，结合疫苗免疫情况和微生物学监测情况，对抗体阳性个体小于占被检总数10%的个体，淘汰阳性个体；对阳性个体数占被检总数的10%以上群体，进行全群病原学监测，将病原学阴性和阳性的鸭分别在不同隔离器内饲养，直至血清学监测结果全部为阴性，净化了HBK鸭群中的鸭病毒性肠炎、鸭病毒性肝炎。为防止病原菌感染，对F2代鸭群连续服用广谱抗生素新霉素和强力霉素，在F3代鸭分别对咽拭子、肛拭子、粪便、隔离器和饲养室墙壁等采样，分离细菌，经DHL鉴别培养、生化试验、针对沙门氏菌毒力侵袭基因和内毒素基因的PCR检测，结果表明无白痢沙门氏菌感染。

2.3.4建立疫病监测标准:微生物的监测方法主要有血清中和试验、琼脂扩散试验、细菌分离、聚合酶链式反应、平板凝集试验、乳胶凝集试验等病原学技术，以及血清凝集抑制试验和酶联免疫吸附试验等血清学方法，不断增加排除的疫病，对鸭瘟等10种病原进行全群血清学和病原学监测，淘汰阳性个体。HBK鸭目前已净化了包括白痢、鸭疫里式杆菌、禽网状内皮组织增生症、禽腺病毒(III群)病、鸭病毒性肝炎I型、鸭病毒性肠炎、禽流感和新城疫等在内的10种疫病，建立了核心群。JD鸭已经排除了禽流感、鸡新城疫、禽腺病毒(Ⅲ群)病、番鸭细小病毒病、鸡白血病、鹅细小病毒病、鸭病毒性肠炎、鸭病毒性肝炎I型、鸭圆环病毒病和鸭坦布苏病等10种疫病，建立了无特定病原体核心群。

2.4 遗传质量控制

由于鸭的遗传学特征与其疫病敏感性、免疫学应答能力和繁殖性能有密切相关性，而且受饲养设施设备的限制，种鸭群的规模无法与常规养殖业相提并论，因此制定SPF鸭种群的遗传学质量控制标准尤为重要，利用微卫星标记和免疫遗传基因提出了团体标准《SPF鸭遗传学监测》，分别针对封闭群和免疫遗传基因单倍体型进行了规定。

2.4.1HBK-SPF鸭群的遗传学监测:利用酯酶1(Es1)、转铁蛋白(Trf)、碳酸酐酶-2(Car2)、葡萄糖磷酸异构酶-1(Gpi1)、酯酶10(Es10)和磷酸葡萄糖转位酶-1(Pgm1)等6种同工酶在HBK鸭不同代次、不同品系和不同组织中的表达进行了研究，结果表明血清中的Es1和Trf、溶血素中的Car2和Gpi1、肾脏中的Pgm1、肝脏中的Es10等6种同工酶在相应的组织中能够出现稳定的带型，重复性较好。检测F2代和F3代，染色结果基本一致，除Car2位点F3代鸭比F2代多一条带，Es10位点F3代比F2代少一条带外，F2代和F3代存在一定程度的多态性，而且相互之间有一定差异，符合封闭群实验动物的遗传学要求[8]。

根据蛋壳颜色选育出B和Q两个品系。利用联合国粮农组织推荐的18对鸭微卫星DNA标记位点，建立了HBK鸭群的分子遗传学检测方法。在F2和F3世代的4个群体中，共检测到80个等位基因。每个位点上的等位基因数最多的为7个，最少的为3个。F2代HBK-B和HBK-Q群体中分别有8个和11个位点属于高度多态位点，平均杂合度分别为0.519±0.160和0.549±0.237；在F3代HBK-B和HBK-Q分别有11和10个位点呈现出高度多态，杂合度分别为0.552±0.192和0.512±0.192，其他位点均呈现中度多态。利用16对微卫星标记对F5代和F6代行遗传多样性分析，共检测到71个等位基因，每个位点的平均等位基因数为4.14，与F2代和F3代相比有所下降；F5代和F6代鸭群偏离哈-代平衡的位点有所减少，分别仅有2个和4个位点显著偏离平衡状态；多态信息含量(PIC)大于 0.5的位点数量减少，F5代2个群体的平均PIC分别为0.511和0.512，F6代2个群体的平均PIC分别为0.48和0.505；F5代2个群体的期望杂合度(He)分别为0.575和0.574，F6代的He分别为0.546和0.566。表明经过6个世代的繁育，偏离平衡的位点减少，以等位基因数目为标志的群体遗传多样性下降，近交程度呈上升趋势，但群体的杂合度则维持相对稳定；Q品系从F2～F6代的遗传背景呈规律性变化，B品系遗传背景存在一定的交替上升或下降，但总体趋于持续的上升或下降[9]。

2.4.2JD-SPF鸭的群体遗传结构分析:采用17个微卫星标记，结合PCR和毛细管电泳技术，在JD-SPF鸭群71个位点共检测到119个等位基因，每个位点上等位基因数为3～13个，大部分位点上检测到的等位基因数都接近于文献报道鸭群有13个位点呈现出高度多态(PIC>0.5)，平均杂合度为0.5816 ± 0.0142，其它位点均呈现出中度多态，有5个位点处于哈-代平衡，其余12个位点显著偏离，达到极显著水平(P<0.01)[10]。

2.5 饲料营养与饮水

目前尚无SPF鸭的饲料营养标准，主要参考商业标准。SPF鸭饲养阶段依据不同生理需要和生产需要分为育雏期、育成期、产蛋前期和产蛋高峰期四个阶段。在参考旱式平养蛋鸭营养需要量的同时，根据隔离饲养和屏障饲养的变化，以及饲料灭菌过程产生的营养损失，制定了《实验动物SPF鸭配合饲料》T/CALAS 17—2017团体标准草案。SPF鸭配合饲料的卫生指标采用“猪鸡鸭用饲料产品安全质量的要求(DB35/562)”，饲料灭菌标准参照“饲料辐照灭菌工艺本标准(DB32/T572)”，辐照强度及灭菌效果参照“饲料辐照杀菌技术规范(NY/T1448)”。

采用自动饮水装置自由饮水，饮用无菌纯化水。定期进行微生物含量的监测，消毒与灭菌效果的评价参照“消毒与灭菌效果的评价方法与标准(GB15981)”。

2.6 生物学特性数据的采集与社会化共享

根据实验禽生物学特性数据及其采集规范，采集HBK-B-SPF鸭和HBK-Q-SPF鸭的生物学特性数据，包括19项血液生理参数、15项生殖生理参数、1项生长发育生理参数、2项种呼吸生理参数、3项心血管生理参数、19项血液生化参数、11项解剖学参数和7项遗传学数据，并进行了差异显著性比较，发现部分数据存在显著性差异，为新品系的建立提供了基础。所有数据都提交国家实验动物数据资源中心(E-平台)，实现了数据资源的社会共享[11-14]。

2.7 疫病敏感性研究

针对HBK鸭进行了网状内皮组织增生症(REV)[15]、禽流感重组鸭瘟疫苗[16]的敏感性分析。利用HBK雏鸭接种鸭疫里氏杆菌24 h后，实验组动物有缩颈、嗜眠、共济失调等症状，36 h后出现死亡。剖检可见心包炎、肝脏表面覆盖一层薄膜状的纤维素性渗出物等RA病典型临床特征[17]；鸭病毒性肝炎I型强毒株感染HBK雏鸭，接种后4 h即可在雏鸭心、肝、脑、肺、胰腺、回肠、盲肠、直肠、法氏囊和脾脏组织中检测到病毒RNA，随着病程发展，RNA拷贝数持续升高，接种24 h后，肝脏中的病毒含量最高，说明强毒在HBK雏鸭的早期感染雏鸭的实质器官、免疫器官和消化系统等均具有广泛的嗜性[18-19]；利用SPF鸭评估了当前在中国鸭群中流行的新城疫病毒基因型，表明比SPF鸡更适合用于评估鸭源新城疫病毒的毒力[20]；利用SPF鸭胚首次发现鸭肠炎病毒感染能引起自噬，为鸭病毒性肠炎的致病机理研究提供了新思路[21]。除了基础研究，在鸭病生物制品研制中也发挥了重要作用[22]。

利用鸭基因组抗原转关相关蛋白TAP的单位点等位基因型，从HBK鸭群选育出4个免疫遗传相关的家系，用鸭疫里氏杆菌感染上述B1、B2、B3 3个纯系和B2/B4杂合鸭，结果死亡率无显著性差异；接种鸭病毒性肝炎I型，结果B2鸭死亡率(36%)明显低于其他型(73%～93%)[23]。接种表达H5亚型禽流感HA基因重组鸭瘟活载体疫苗，结果9周内B3群鸭血凝抑制抗体效价始终显著高于B1、B2和B4群[16]。表明HBK鸭的TAP等位基因型与鸭病的致病性和免疫应答能力有关。