MscL与抗生素的相互作用及其潜在用途

江 兰，王晓敏，唐思阳，李月舟

(浙江大学 医学院，杭州 310058)

21世纪，全球死亡人数的四分之一源于微生物感染，霍乱与结核被发现再次成为威胁人类生命健康的致命疾病[1]。人类面临的一个主要医疗问题是细菌引起的某些重症感染被发现已对常用抗生素产生了抗性[2]。青霉素广泛使用后仅一年，相当数量的金黄色葡萄球菌(Staphycococcusaureus,S.aureus)对青霉素形成了抗性；几年后，超过50%的金黄色葡萄球菌不再对青霉素这种药物敏感[3]。目前，每天都有越来越多的常见或罕见的细菌被报道对不同类型的抗生素形成耐药性，抗生素的过量使用和病人未按医嘱完成完整的抗生素治疗方案都在促使耐多药细菌(multi-drug resistance, MDR)的出现[4]。耐药菌如肠杆科细菌、结核杆菌、肺炎杆菌与淋球菌正严重威胁人类健康。但是由于财政、管理和科学等诸多障碍，新药的研发进程已减缓甚至停滞[5-6]。因此，治疗病人的MDR细菌感染日益困难。目前，在抗生素的开发渠道研究中仅存在几种相对较新的小分子[7]。MscL在细菌中普遍存在且氨基酸序列高度保守，此外，人类基因组不含MscL的基因。MscL被认为是 20种最为顶尖的药物靶标之一[8]。因而，本文就MscL与抗生素的相互作用及其在药物输送过程中的潜在用途进行综述。

1 机械敏感通道

机械敏感通道(mechanosensitive channels, MS), 或称“机械门控通道”，是一种跨膜通道蛋白，可以感受细胞膜表面的张力，将外界的物理刺激转化为胞内的生化信号，从而影响细胞的生命活动[9-10]。

1.1 机械敏感通道的分布

MS通道最早在鸡骨骼肌细胞中发现[11]。随着研究的深入，发现其在动物、植物与细菌中广泛存在[12]。在哺乳动物中，MS通道涉及众多的生理功能，如细胞生长、细胞容积调节、血压调控、听力、触觉、平衡和痛觉；许多疾病，如神经与肌肉退变、动脉硬化、高血压、心律失常和青光眼等，都与MS通道异常有关[12-13]。

1.2 细菌上的机械敏感通道

目前，在大肠杆菌中已知有4种MS通道，根据电导将其分为MscM(mini, M)、MscS(small, S)、MscK(potassium, K)和MscL(large, L)[14]。迄今为止，研究最为透彻的是大电导机械敏感通道MscL。大肠杆菌MscL由5个相同的亚基构成，每个亚基含有136个氨基酸，分子质量约为17 ku，其大部分氨基酸为非极性氨基酸，不含半胱氨酸(Cys)；每个MscL亚基含有两个跨膜区域( transmembrane1, TM1与 transmembrane 2, TM2), 一个细胞外Loop区域和位于细胞内的N端与C端[15]。研究表明TM1形成MscL的孔道，TM2位于孔道外侧并和膜脂质作用； MscL直接感知细胞膜上的张力而开放，并介导离子、小分子、甚至小的蛋白质通过细胞；MscL不具备离子选择性，溶质的分子直径为其唯一的选择依据[16]。

在革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌与古细菌中都有发现MscL的存在，而且细菌MscL的氨基酸序列具有很高的保守性，TM1和TM2中部分氨基酸位点的保守性可高达90%和80%[17-18]。但在哺乳动物和人类基因组中并没有发现有MscL的同源体。MscL最早在大肠杆菌(E.coli)中发现。研究发现，在细菌的渗透调节过程中，MscL作为 “紧急释放阀”而起作用：在细菌的外部环境的渗透压急剧下降时，首先，水开始进入细菌细胞引起细胞膨胀，细胞膜上产生张力；然后，细胞膜上的MscL直接感知张力而开放并且形成一个直径约为30 Å的通道，释放胞内物质，维持渗透压的平衡，从而避免细胞的裂解[19]。MscL敲除的大肠杆菌对低渗冲击特别敏感，而表达MscL后，其低渗致死的表型可以被恢复正常[20]。MscL对细菌的生长也有非常重要的作用，MscL功能异常的突变体会释放细胞内容物导致细菌的生长缓慢甚至引起细菌死亡。因此，必须严格调节与控制MscL的开放。

结构和功能的研究显示MscL是5个TM1紧密捆绑构成一个漏斗状结构的通道，在胞质侧形成一个疏水的限制性位点，此位点的通道直径约2Å，为整个通道最窄的位置。限制性位点作为通道的闸门而发挥作用，因此，在MscL的开放过程中，疏水闸门的直径范围约为2Å～30Å[21]，小分子药物可凭借MscL进入细菌，影响细菌的生长；并且，MscL纯化重组于人工膜仍然能够保持原有的活性与功能[22]。因此，对于药物而言，MscL是一个非常好的靶标。

2 MscL与抗生素的相互作用

2.1 MscL增强链霉素的药效

链霉素是人类发现的第一种氨基糖苷类抗生素，产生于放线菌属中的链霉菌。自1944年发现以来，其作用机制得到了广泛的研究。它的主要作用机制为：首先，链霉素进入细胞；然后，它与核糖体30S亚基的S12蛋白结合并抑制翻译，并且可能引起mRNA误读[23]。链霉素广泛用于治疗由革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌引起的细菌感染疾病，如结核病、心内膜感染、脑膜感染和瘟疫[24-25]。

但是，体积大且带电荷的链霉素进入细菌细胞内部的机制在很大程度上是未知的。直到最近，有研究报道MscL通道的表达极大程度地增加了链霉素与二氢链霉素的效力，然而在MscS通道表达时没有观察到效力差异，这似乎表明链霉素特异性地直接激活通道MscL[26]。目前，有研究人员发现了链霉素进入细胞的一种新机制：二氢链霉素与MscL的特定部位(如E.coliMscL 第19位亮氨酸L19)直接结合并修饰MscL通道构象，MscL通道被激活和打开，胞内的K+外流，导致细胞膜电位超极化；超极化加大了细胞内外的电化学梯度，使胞外的带正电的链霉素更容易进入细菌细胞，从而增强链霉素的药效[27]。

数据表明，直径小于30Å的化合物则可以通过MscL[28]。而链霉素的直径约为10Å，因此，通道MscL可以介导链霉素进入细菌细胞，从而杀灭细菌。因此，MscL可能是链霉素进入细胞质的一种新途径。此外，在未表达MscL的菌株中，链霉素仍有药效(但此时需要更高浓度的链霉素)[26]。这表明，链霉素还可以凭借MscL外的其他途径进入细胞。MscL不但可以增强链霉素的药效，还可以增强其他一些药物的药效。如奇霉素、紫霉素、硝呋奇特等抗生素在MscL表达的菌株药效能得到极大增强[26]。

综合结果表明，MscL可以增强抗生素进入细胞质的效率，从而增强抗生素的药效。这表明可以将MscL作为抗生素研究的靶标。

2.2 MscL协助治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染

金黄色葡萄球菌是造成伤口化脓的主要原因，它主要感染皮肤与软组织等，它是威胁人类健康的主要致病菌之一[29]。1959年，甲氧西林开始用于治疗耐青霉素S.aureus引起的感染；1961年开始，英国首先发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantS.aureus, MRSA)；迅速地，其他欧洲国家、日本、澳大利亚和美国也陆续发现MRSA[30]。由于新型抗生素研制的缓慢，使得“超级细菌” MRSA的治疗越来越难。为了解决这个问题，澳大利亚和美国的研究人员以MscL为靶标设计了一类新型抗生素10(1,3,5-tris[(1E)-2′-(4″-benzoic acid)vinyl] benzene )[31]。研究显示，抗生素10是一种有效的抗生素，可治愈感染MRSA的秀丽隐杆线虫。目前，许多MRSA引起的感染使用糖肽类抗生素治疗，如万古霉素[32-33]。按照FDA的标准，治疗MRSA感染，万古霉素的治疗浓度范围为20～40 μg/mL。然而，仅约1.5 μg/mL的抗生素10，即可有效治疗MRSA感染。

研究显示，抗生素10对革兰氏阳性菌具有很强的药效，但对革兰氏阴性菌的作用较小[34]；抗生素10对阴性菌的药效较弱，可能是由于革兰氏阴性菌含有脂多糖外膜保护细菌。尽管抗生素10对MRSA感染的治疗十分有效，但是它在治疗浓度下在人和哺乳动物细胞系中均没有显示细胞毒性[35-36]。因此，以MscL为靶标的抗生素10是一种极具潜力的抗菌试剂。这也表明将MscL作为靶标来研发新药以治疗耐药菌感染是一个很好的研究方向。

3 MscL的潜在用途

MscL能够在体外表达，并且当MscL纯化重组于脂质双分子层后仍具有机械敏感性；MscL的激活不需要其他蛋白等辅助成分，完全依赖于脂质双分子层，脂质双分子层的厚度、膜的刚度与脂质单分子层的自发曲率都会影响MscL的机械敏感性[22, 37]。此外，MscL具有极大的开放孔径和广泛的物质通透性。MscL的这些特征，促使它在药物的摄入与释放应用研究中十分具有吸引力。

3.1 MscL可介导药物进入细胞

目前，不能透过细胞膜的生物大分子主要依靠细胞穿透肽(cell-penetrating peptides, CPPs)介导进入细胞，CPPs已经成为大分子跨越细胞膜的有效工具，但是生物分子必须与CPPs有关联才可以透过细胞膜进入细胞[38]。因此，对于没有关联CPPs但又需要进入细胞发挥其作用的生物活性分子，必须寻找其他途径。

例如，生物活性分子——鬼笔环肽，它不易透过细胞膜，但是它是微丝的特异性标志物，因此在微丝的相关研究中需采取特殊的理化处理，鬼笔环肽才可透过细胞膜进入细胞，这给研究工作带来不便[39]。MscL虽然只存在于细菌，但是MscL可以人工重构于哺乳动物细胞，并且其仍然具有完好的生理功能[40]。因此，有研究人员将MscL在体外表达，并将其重构于哺乳细胞，发现一些重要的生物活性分子如鬼笔环肽、聚赖氨酸肽、乳铁蛋白衍生肽等不能透过细胞膜的大分子通过MscL进入哺乳动物细胞[41-42]。

因此，MscL可介导不能透过细胞膜的生物活性分子转运进入哺乳动物细胞，表明MscL可作为转运工具将多肽或者药物分子转入细胞，这为药物的摄取提供了新的研究方向。

3.2 MscL可调控药物释放

大肠杆菌MscL作为大电导的机械敏感离子通道，是目前研究最为清楚的通道蛋白之一。MscL通道的开放需要克服极大的能量障碍，因此，在正常的情况下MscL通道是关闭的；但是，当细胞膜上的压力达到阈值时，MscL通道的构象将发生变化，由闭合转为开放[43]。

通常情况下，MscL的开放是来源于膜上的压力刺激。然而，引进极性或者带电氨基酸，以及其他带电化合物到E.coliMscL的第22位氨基酸或者第26位氨基酸的位置同样会引起MscL的自发开放[44-45]。研究显示，MscL的两个氨基酸位点G22或者G26突变为半胱氨酸，然后用人工合成的光敏感化合物修饰G22C或者G26C，用波长为366 nm的紫外光照射MscL通道，光敏感化合物将会发生电荷分离，引起与化合物连接的MscL通道打开；然后再用可见光照射MscL通道，通道则回到关闭状态[46-47]。在光照条件下，修饰后的MscL的开放或者关闭是可调控的。

因此，MscL作为一个在光照下可自由开放与关闭的纳米阀门，为今后研究调控药物的释放提供了一个新的研究方向。

4 总结与展望

数据显示，细菌耐药性问题已经成为一个全球问题，革兰氏阳性菌，特别是金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌和肺炎链球菌的耐药性问题对人类健康构成严重威胁[48]。尽管耐药菌日渐增多，但是新药的研发进程却十分缓慢[49]，因此，人类急需寻找能有效抑菌的药物或者治疗方案。大量的实验数据表明，MscL通道具有在细菌中普遍分布和在不同细菌中有很强的序列保守性等多方面的特点，使得MscL靶标在治疗细菌感染有很好的前景[47-50]。近年来，关于MscL的研究逐渐增多，研究人员开始注意MscL在治疗耐药菌方面的应用，研究主要集中于E.coliMscL，但是并没有E.coliMscL的晶体结构。这需要尽快获得E.coliMscL的晶体，将理论知识与晶体结构相对应，考虑设计药效更强的药物分子。目前，其他细菌中的MscL的研究仍然较少，因此，也需要加大在其他种类细菌中的MscL研究，积累更多的理论依据，确定不同细菌中的MscL与抗生素作用的机制，在理论指导下筛选或者设计有效的药物分子。

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