真菌中COP9 信号复合体的研究进展

杨 晓, 王明爽, 李红叶

(浙江大学 农业与生物技术学院生物所，杭州 310012)

蛋白质是生命活动的主要承担者，其合成与降解的动态平衡，是细胞行使各种生物学功能的基础。真核细胞内，蛋白质降解主要通过泛素蛋白酶系统(Ubiquitin-proteasome system, UPS)[1]进行，该系统由泛素分子(ubiquitin)、泛素活化酶(E1)、泛素结合酶(E2)、泛素连接酶(E3)以及 26S 蛋白酶体(Proteasome)组成。泛素连接酶 (Cullin-RING ubiquitin ligases, CRLs) 是 E3中最大的家族，它在真核生物的细胞生长、分化、繁殖、生物节律等生命过程中发挥重要作用[2]，一个典型的CRL复合体包括 Cullin 蛋白、RING 蛋白、调节蛋白和底物识别蛋白[3]。

COP9 信号复合体(COP9 signalosome, CSN)是真核细胞内高度保守的多亚基蛋白复合物，最早作为光形态建成中重要的转录因子发现于拟南芥中，它在黑暗环境下能抑制多种基因转录，随后哺乳动物、果蝇、线虫、酵母等真核生物中相继发现CSN的存在。

CSN主要的生物学功能是调节泛素介导的蛋白降解，目前已知的调控方式有4种：1)Nedd8是一种类泛素蛋白，它与Cullin蛋白结合后(称为Neddylation)能加速CRLs复合体的组装，促进底物泛素化从而加速蛋白降解，而CSN作为一个异肽酶能将Nedd8从Cullin蛋白上切除，造成Cullin蛋白的脱Nedd8修饰(称为Deneddylation)从而影响蛋白降解[4]；2)CSN能与CAND1配合来调控CRLs复合体的组装、分解，维持CRLs组分的活性及稳定性[5]；3)CSN能与CRLs复合体进行物理结合，这会阻碍靶标基质与泛素结合酶E2的互作，从而降低CRLs复合体的活性[6]；4)CSN能与脱泛素酶UBP12/USP15结合来抑制CRLs组分的泛素化，从而维持 CRLs复合体的稳定性[7]。

除调控泛素相关的蛋白降解外，CSN也参与多种生理生化过程的调节。在植物中，CSN参与调控光形态发生、花器官发育、信息素信号转导、植物抗病性等众多生理过程，在动物中，CSN参与调控细胞周期、肿瘤形成、心肌细胞存活等多种生命活动。高等真核生物中，任何一个CSN亚基的缺失突变株都会致死，而低等真核生物中，对应的突变株能够存活且遗传信息能在子代中稳定遗传，因此真菌成为研究CSN在系统进化、结构组成、生物学功能方面的理想材料[8]。本文对真菌中CSN的结构组成、生物学功能进行了详细介绍，以期为真菌及其他真核生物中CSN的研究提供一定的参考数据。

1 真菌CSN的亚基组成

传统研究认为CSN最多包含 8 个亚基，即CSN1-8，但最新研究发现CSN包含第九个亚基CSNAP[9-10]，其中CSN1-4，CSN7-8含有 PCI 结构域(proteasome, COP9 Signalosome, initiation factor 3)，这6个亚基形成马蹄形环状结构，而CSN5和CSN6 含有MPN 结构域(Mpr1-Pad1-N-teminal domain)，这2个亚基以异源二聚体的形式位于马蹄环当中[11]。另有研究认为，CSN1/2/3/8 和CSN4/5/6/7是两个相互对称的模块，两者通过 CSN1 和 CSN6 间的互作进行连接[12]。CSN中富含α螺旋的PCI结构域可以介导各亚基间的互作，使各亚基形成一个整体，而每个亚基的稳定性又依赖于CSN整体的存在。

一些低等真核生物会缺少某些CSN亚基，甚至拥有自己独特的亚基，说明CSN的亚基组成具有物种特异性[8]，拟南芥、人、小鼠和果蝇等真核生物的CSN包含8个亚基，秀丽隐杆线虫的CSN缺少CSN8亚基。真菌中，酿酒酵母CSN的亚基组成最为特殊，包括CSN11、CSN10、RPN5、CSN5、CSI1和CSN9共6个亚基，分别是高等真核生物中CSN1、CSN2、CSN4、CSN5、CSN6和CSN7的同源亚基[13]，除CSN5外，其他各亚基与其同源亚基的同源性都非常低。裂殖酵母的CSN缺少CSN6、CSN8这2个亚基[14]，粗糙脉孢菌的CSN缺少CSN8亚基[15]，构巢曲霉的CSN包含完整的8个亚基[16]。Barth等从进化角度对61种真核生物的基因组进行分析发现，包括复细胞动物、变形虫和一些真菌在内的真核生物中能够检测到CSNAP的同源亚基[10]。

2 真菌CSN的生物学功能

与高等真核生物不同，真菌CSN亚基缺失突变株不致死，而是出现各种异常的表型，主要表现在真菌的生长发育、生物钟、代谢调控、敏感性、对细胞核物质的影响、CSN的脱Nedd活性6个方面。目前真菌中CSN的研究对象包括酿酒酵母、裂殖酵母、粗糙脉胞菌和构巢曲霉，此外其他真菌中暂无研究。鉴于CSN功能的保守性，真菌与其他真核生物中的研究成果可以相互启发，一些无法在高等真核生物中展开的研究也可将真菌作为替代对象。

2.1 真菌的生长和发育

不同CSN亚基对真菌菌丝生长、子实体发育的作用不同。构巢曲霉中，CSN4或CSN5缺失突变株虽能起始有性发育形成原基，但细胞壁和子囊孢子的进一步分化和成熟受阻，并且在生长后期出现短且高度分枝的菌丝，说明CSN能影响构巢曲霉的有性发育及菌丝的顶端延伸[17]。随后Busch等补充发现，CSN1、CSN2及CSN5中的JAMM结构域对构巢曲霉的有性发育也非常重要[16]。除影响有性发育外，CSN也会影响有性发育和无性发育间的平衡，构巢曲霉中PPOA、PPOC两个基因能对类激素信号PSI因子进行调控，其中PPOA促进有性发育，PPOC促进无性发育，CSN通过调控PPOA 和 PPOC 的比例来调节构巢曲霉的有性发育和无性发育[18]。

粗糙脉孢菌的CSN包含CSN1-7共7个亚基，只有CSN3缺失突变株表型与野生型一致，其余各亚基的缺失都会使菌丝生长、分生孢子发育出现不同程度的缺陷[19]。Zhou等进一步发现，对CSN5 JAMM结构域中关键位点(EXnHXHX10D)进行点突变会破坏CSN的脱Nedd活性，但并不影响脉孢菌的生长发育，且点突变的CSN5亚基能恢复CSN5缺失突变株中的表型缺陷，说明对脉胞菌的生长发育而言，CSN的完整性比脱Nedd活性更重要[20]。

2.2 真菌的生物钟

粗糙脉孢菌中，除CSN3外任何亚基的缺失突变株生理节律都表现出不同程度的缺陷，其中CSN2、CSN5的缺失使SCFFWD-1复合物中FWD1蛋白、CUL1蛋白的含量及稳定性降低，导致生物钟蛋白FRQ的泛素化及降解受阻，从而出现异常的产孢节律。与此相反，CSN5 JAMM 结构域的点突变株虽丧失脱Nedd活性，但生物钟未受影响，说明对粗糙脉胞菌的生物钟而言，CSN的完整性比脱Nedd活性更重要[15, 19-21]。值得一提的是，脉孢菌和动物中对生物钟的调控是保守的，而人类Smith-Magenis综合征病人中CSN3存在共同缺陷，根据脉胞菌中的研究成果推测，该病中生理节律混乱、睡眠扰乱的症状可能源于CSN功能的缺失。

2.3 真菌的代谢调控

Chen[22]和Licursi[23]等通过转录组和蛋白组分析发现，酿酒酵母CSN5缺失突变株中蛋白合成相关基因普遍上调、糖运输相关基因明显下调、氨基酸合成相关蛋白明显增多，此外CSN5还参与脂类代谢、麦角甾醇合成相关基因的调控，其他CSN突变株中也存在相似的基因调控模式，说明CSN在酿酒酵母代谢中具有重要作用[22-23]。次级代谢与真菌发育密切相关，Nahlik[8]和Busch等[16-17]发现，敲除CSN4、CSN5或者对CSN5亚基JAMM活性核心中3个保守的氨基酸位点进行定点突变，均会影响构巢曲霉的次级代谢，其中CSN5的缺失会导致氧化还原酶相关基因表达上调、发育过程中葡聚糖酶的激活受阻且细胞壁功能相关基因表达下调、杂色曲霉素合成途径失调、苷色酸及其衍生物的积累，具体表现为：突变株氧化压力应答受损并积累不常见的次级代谢产物，发育过程中细胞壁的重塑受阻，积累各种杂色曲霉素的中间产物及向培养基中释放红色物质等。这些结果表明CSN5能协调多种代谢途径来保证构巢曲霉的生长发育正常进行。

2.4 真菌的敏感性

真菌的敏感性既包括对激素等内部信号的敏感程度，也包括对金属离子、化学试剂、氧化压力等外部信号的敏感程度。酿酒酵母中，不同的CSN缺失突变株对信息素的敏感程度不同，从而对交配效率产生不同的影响，这种影响与CSN的脱Nedd活性无关，具体表现为：与野生型菌株相比，CSN5、CSN9、CSN12缺失突变株交配效率提高了100%；CSN10、PCI8缺失突变株交配效率无变化；CSI1缺失突变株交配效率显著降低[24]。此外，Licursi等发现酿酒酵母中CSN5能对锌代谢相关基因进行调控，CSN5缺失突变株细胞内锌浓度增加且对培养基中低浓度的锌、镍、镉变得敏感，突变株对酮康唑敏感性增强，对制霉菌素抗性增强[23]。

构巢曲霉发育过程中CSN5的缺失会影响至少15%的基因的转录，并伴随蛋白质组的改变，导致突变株氧化还原调控受损并对氧化压力高度敏感。此外，敲除CSN5或对CSN5 JAMM 结构域进行突变均会增强突变株对激素的敏感性[8, 15]。

2.5 对细胞核物质的影响

核苷酸还原酶是由2个大亚基(CDC22)和2个小亚基(SUC22)组成的异质四聚体，一般情况下CDC22位于细胞质，而SUC22被锚定蛋白SPD1固定于细胞核，大小亚基分离，一旦细胞进行DNA复制，锚定蛋白SPD1将被泛素蛋白酶系统降解，使细胞核中的SUC22释放到细胞质中从而与CDC22结合成有活性的核苷酸还原酶。裂殖酵母中CSN1或CSN2的缺失会阻碍锚定蛋白SPD1的泛素化及降解，使SUC22与CDC22无法结合成完整的核苷酸还原酶，导致突变株S阶段延迟并对DNA损伤、UV变得敏感，过量表达SUC22或敲除SPD1均能恢复这些表型缺陷，再次证明CSN能影响核苷酸还原酶的活性[14, 25]。此外，CSN能与Brc1以一种独立且互补的方式在裂殖酵母DNA损伤修复及基因组稳定性方面共同发挥作用[26]，且CSN1、CSN2 的缺失会使异染色质产生缺陷[27]，而其他的CSN缺失突变株没有可识别的表型。

面对不同的DNA损伤药剂，构巢曲霉野生型菌株中CSN4、CSN5的mRNA稳定性增强且含量增加，而CSN4、CSN5缺失突变株生长减慢且对DNA损伤药剂变得敏感，说明CSN与构巢曲霉DNA损伤应答相关，进一步研究发现DNA损伤应答过程中CSN4、CSN5与NPKA、UVSBATR存在遗传互作[28]。

2.6 CSN的脱Nedd活性

酿酒酵母中的CSI1与哺乳动物中的CSN6功能相同，CSI1中的S6CD 结构域与CSN6中的羧基末端有明显的同源性但缺少氨基末端的MPN--结构域，这并不影响酿酒酵母CSN的脱Nedd活性[29]，但任何一个CSN亚基的缺失都会使酿酒酵母丧失脱Nedd活性[24]。对哺乳动物CSN6突变株(包含羧基末端的S6CD结构域，但缺少MPN--结构域)进行研究发现，MPN--结构域的缺失不会影响CSN的组装及脱Nedd活性，这与酿酒酵母中的情况相同[29]，再次说明MPN--结构域对于脱Nedd活性是非必需的。此外，Cirigliano等经过一系列研究和验证发现了2种未命名的小分子片段能够抑制酿酒酵母CSN5的脱Nedd活性[30]。

裂殖酵母中CSN1-5均会影响CUL1蛋白和CUL3蛋白的Nedd化状态[14]，但只有CSN1 和CSN2 会影响CUL4蛋白的Nedd化状态[25]，说明CSN对不同的Cullin蛋白有不同的作用机制。此外，CSN能协助脱泛素酶UBP12p定位于细胞核中的Cullin蛋白，从而维持CRLs的稳定[31]。

粗糙脉孢菌中除CSN3外，其他任何亚基的缺失均会影响CSN的脱Nedd活性及CUL3、CUL1、BTB蛋白的稳定性[19-20]，而CSN5 JAMM结构域的点突变株虽丧失脱Nedd活性，但CSN的组装、CSN与Cullin蛋白的互作及SCFFWD-1复合物稳定性均不受影响，说明对于维持CRLs的稳定性而言，CSN的完整性比脱Nedd活性更重要。值得一提的是，CSN3的缺失会减少CSN复合物的数量并形成CSN4/5/6和CSN4/5/6/7等一些亚复合物[19-20]。

构巢曲霉中任何CSN亚基的缺失均会导致脱Nedd活性丧失，其体内7个亚基(CSN1-4, 6-8)的CSN复合物只有与CSN5整合后才具有脱Nedd活性，表明CSN5的融合是构巢曲霉CSN组装的最后一步，这与LID亚复合物的组装顺序有明显区别[32-33]。

2.7 其他

PCI家族包括CSN、LID亚复合物、真核翻译起始因子(EIF3)，它们共同调控从蛋白翻译到蛋白降解的整个过程，三者间具有序列同源性、相似的结构排布并且彼此互作[34]，相对于EIF3，CSN与LID的联系更加紧密且具有极高的相似性，但也有明显的区别及不同的组装顺序[35]。酿酒酵母中CSN11能与EIF3互作，CSN9 和CSI1能与LID中的RPN5互作[36]，除了三者间的互作，各CSN亚基会影响彼此的定位，野生型菌株中CSN5以复合物的形式聚集在细胞核，而CSN12缺失突变株中CSN5以单体形式存在，说明CSN12对于维持CSN的稳定性非常重要，此外，CSN12、CSN10、PCI8/CSN11、CSI1均会影响CSN5在细胞内的定位[36]。裂殖酵母中也有相似的结论，CSN4与CSN复合物的结合需要CSN1、CSN2和CSN5的协助，而任何一个CSN亚基的缺失都会影响到其余亚基特异性的核定位[14]。

许多真核生物中除CSN外，还有另外的脱Nedd酶DEN1，两者间的明确分工还未彻底明确，构巢曲霉中两者参与不同的生活史，CSN主要调控有性生活史及次级代谢，而DEN1主要影响无性生活史[37]，两者间的互作与平衡会影响细胞内蛋白的稳定性、脱Nedd活性及发育中的光反应等，CSN5/DEN1双敲菌株结合了两个单敲菌株的表型，即多细胞发育严重受损、主要进行营养生长并产生红色色素。此外，CSN3、CSN5、CSN6、CSN7和CSN8能调控细胞核内DEN1的稳定性[37-38]。

3 小结与展望

本文对真菌中CSN的亚基组成及生物学功能进行了总结，虽然有很多突出成果，但仍有很多问题亟待解决，未来可就以下几个方面做进一步研究：1)CSN与真菌致病性的关系。目前的研究多集中在模式真菌，CSN在其他病原真菌及真菌致病性方面的功能尚未研究，开展这方面的工作可为控制真菌病害提供新思路。2)CSN与生物工程。真菌发育与次级代谢密切相关，一些次级代谢基因簇在常规生长条件下保持沉默，而一些CSN突变菌株能将这些基因激活从而获得新的次级代谢产物或增加已知的次级代谢物的产量，这可以为生物制药、病害防治等提供新的思路[8, 39-40]。3)CSN与VEA、CAND1基因的确切关系。构巢曲霉中，VEA、CAND1、CSN突变株间有相似的表型，这些基因间的确切关系有待深入研究[17, 41]。

此外，由于CSN的功能具有保守性，因此真菌中的很多研究成果，如CSN对生物钟的调控、CSN对脂类代谢的调控、CSN与DEN1间的互作形式等，可以为其他真核生物中CSN的研究提供一定的参考。

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