肉毒毒素检测方法研究进展

王江，徐华，谢剑炜

军事医学研究院 毒物药物研究所，北京 100850

肉毒神经毒素（botulinum neurotoxin，BoNT）主要由肉毒梭状芽孢杆菌产生，是已知对人类毒性最强的天然蛋白质毒素，能够引起人和动物中毒乃至死亡，对人的半数致死量（LD50）为0.1～1 ng/kg。天然发生的食源性肉毒中毒主要是由于罐头等食品加工生产不当引起的，吸毒者创伤性肉毒中毒也处于上升趋势。同时，A型肉毒毒素（BoNT/A）和B型肉毒毒素（BoNT/B）已经商业化发展成为各种局部肌张力障碍、自主神经功能障碍和医疗美容等的治疗药物[1]，治疗过程中时有中毒事件发生，对其注射液的安全性评价显得尤为重要。此外，因其高毒性和易于生产，肉毒毒素成为潜在的生物武器和生物恐怖袭击战剂[2]。因此，建立对肉毒毒素快速且灵敏的确证检测方法具有极其重要的医学和军事意义。

1 肉毒毒素结构与分类

根据其抗原属性（产生毒素的抗原性），可将BoNT分为7个血清型，即A～G型。人类肉毒中毒主要由A、B、E型引起，偶尔由F型BoNT引起，C型和D型主要引起禽畜和动物中毒。BoNT可经黏膜表层吸收[3]。7种血清型中，A型毒性最强，其次是B、E、F型。

BoNT从肉毒杆菌中以复合物的形式释放，包含各种非毒性的保护毒素，以免受水解蛋白和胃肠道酸性环境降解[4]。BoNT的相对分子质量（Mr）约为150×103，由4个结构域组成三维空间结构，BoNT/A是最早确定晶体结构的血清型全毒素[5]。肉毒毒素在内源或外源性的蛋白水解酶作用下被切割为重链（HC，Mr约为100×103）和轻链（LC，Mr约为 50×103）而显示其毒性[6]。重链便于毒素通过内吞作用进入神经元细胞，轻链作为锌依赖的金属蛋白酶，普遍被认为是肉毒毒素的毒性部分。轻链能够特异性地酶切可溶性亚酰胺敏感因子吸附蛋白受体（SNAREs），SNARE蛋白家族是神经递质释放所必需的蛋白，能够催化膜融合，主要包括位于转运小泡膜上的VAMP［也称作突触小泡蛋白（synaptobrevin）］、位于突触前膜上的SNAP-25和突触融合蛋白（syntaxin），以及一些胞质蛋白。一个SNARE蛋白的裂解能阻断神经递质的释放和相关神经肌肉接头的失活，最终导致肌肉麻痹[7]。肉毒毒素对其底物具有高度选择性[8]，A和E型特异性酶切SNAP-25蛋白，B、D、F和G型特异性酶切VAMP蛋白，C型的酶切底物则为突触融合蛋白和SNAP-25蛋白[9]。尽管肉毒毒素各结构域的作用已知，由离子键紧密连接的重链和轻链分开的机制仍不清楚[10]。

2 肉毒毒素检测方法

2.1 小鼠生物试验法（mouse bioassay，MBA）

小鼠生物试验法是公认的肉毒毒素检测“金标准”，能评估活性毒素的整体功能（例如结合、转位和水解功能），检测肉毒毒素的7种血清型。该实验以小鼠半数致死量（mouse median lethal dose，MLD50）为基础，给多组小鼠腹腔注射系列浓度梯度的毒素样本，以确定当半数小鼠死亡时的毒素浓度。对于检测BoNT/A，MBA的灵敏度可达10 pg/mL，此浓度与1 MLD50/mL一致[11]。尽管该检测方法灵敏度高，但是存在一定的局限性：每种血清型毒素的检测都需要1 mL体积的样品，最理想的状态是＞4 mL的样品量，当样品采自婴儿粪样或食物残留物时，难以满足检测需求；此外，尽管该方法能在24 h内得出阳性结果，但是需要4～5 d确证阴性样品或低浓度样品[12]；样品中存在其他细菌或微生物时，也会对试验造成干扰。由于MBA法用于肉毒毒素检测存在其局限性，以及提倡减少活体动物的使用，许多体外检测方法迅速发展起来。

2.2 免疫学检测方法

2.2.1 酶联免疫吸附实验（ELISA） 在过去30年中，ELISA成为最广泛应用于肉毒毒素血清型鉴定和检测的技术，该方法以抗原抗体反应为基础，夹心免疫分析法是最常见的形式，使用2种毒素特异性的抗体，其中一种作为捕获抗体，另一种作为检测抗体。抗肉毒毒素的捕获抗体与待测样品结合，加入酶标记的检测抗体，显色后在酶标仪中检测比色或发光信号，产生的信号强度通常与样品中毒素的量成比例[13]。对ELISA法进行改进能提高其检测肉毒毒素的灵敏度，例如采用噬菌体肽库筛选技术筛选出的环肽作为捕获抗体，抗BoNT/A多克隆抗体作为检测抗体，采用化学发光ELISA法，检测灵敏度可达1 pg/mL。近年来，夹心免疫分析法使用高亲和力单克隆抗体检测BoNT/A和BoNT/B，检测限低于小鼠生物试验法（10 pg/mL）[14]。但是ELISA方法也存在其缺点，例如不能确定毒素是否仍具有功能活性，检测复杂临床样品时灵敏度较低，容易发生交叉反应导致假阳性结果等。

2.2.2 免疫色谱法（immunochromatography assays，ICA） 侧向层析和柱层析是免疫色谱法中的2种方法，二者在检测速度和便于现场使用方面具有很大的优势。侧向层析是一种便携式的在硝酸纤维条上反应的试纸，将捕获抗体滴于硝酸纤维支架上，其他的反应试剂（例如检测抗体、缓冲液、控制抗体）干结到反应板上。待测样品滴到反应板（样品带）上发生水合作用，毒素与检测抗体结合后从样品带迁移到检测带被捕获抗体捕捉。该捕获步骤使毒素浓缩并与标记后的二抗结合形成复合物，产生明显的有色条带。常见的标记如胶体金，能与毒素样品产生红色条带，或是不同颜色的与检测抗体结合的乳球[15]。

侧向层析分析速度快且成本低，是理想的肉毒毒素快速确证方法，但其应用仍然存在一定的局限性。首先，侧向层析的灵敏度为10～20 ng/mL（具体取决于毒素类型）[16]，与其他快速检测方法相比仍较低；其次，侧向层析仅能提供肉眼可见的定性结果，无法对毒素进行定量。随着更高亲和力的抗体和更好的检测标记物的可实现，侧向层析的灵敏度有望提高。近年的研究表明，采用单一的侧向层析试纸能够同时辨别和确证BoNT/A、BoNT/B，表明侧向层析试纸有望成为食品安全领域强有力的分析工具[17]。

2.2.3 免疫PCR法（immuno-PCR） 免疫PCR法与ELISA相似，被分析物的检测是以抗原-抗体复合物的形式为基础，结合抗体的特异性与报告DNA分子通过PCR扩增，发展出检测BoNT较为灵敏的方法。该法使用的检测抗体是与报告DNA分子结合的抗体，而不是一种酶。DNA分子与毒素特异性检测抗体结合后通过传统PCR或实时PCR很容易实现扩增，免疫PCR检测BoNT/A检测限可达5 pg（50 μL体系中），采用相同抗体检测时，免疫PCR法的灵敏度可比ELISA提高1000倍[18]。Chao[19]等采用生物素化的报告DNA分子通过链霉亲和素与生物素化的抗体结合，并优化报告DNA分子与链霉亲和素的量以降低背景干扰，检测BoNT/A的灵敏度可达50 fg（50 μL体系中）。

2.3 基于生物传感器的检测方法（biosensor based assays）

与毒素检测相关的一些特定传感器技术有阵列生物传感器法（array biosensor assay）、芯片ELISA法（ELISA-on-a-chip，EOC）和适配体电化学方法（aptamer-electrochemical assay）。对于肉毒毒素的快速检测，生物传感器技术已经发展了以表面等离子共振、折射、荧光和化学发光为基础的技术，这些技术通常取决于毒素-蛋白（通常是一种抗体）的结合，结合的结果能直接测量[2]。Han[20]等发展了结合ELISA和免疫色谱技术的EOC法用于现场侦检，产生的比色发光信号能被基于电感偶合的检测器检测，定量检测BoNT/A的灵敏度为2 ng/mL。然而，生物传感器技术与ELISA方法相比通常缺乏足够的灵敏度、特异性和重复性。

2.4 荧光共振能量转移法（fluorescence resonance energy transfer，FRET）

荧光共振能量转移是依赖于供体和受体分子间距离的光物理进程，处于激发态的荧光团通过偶极子间的相互作用，将能量以非辐射的方式转移给邻近的受体分子，从而导致供体荧光淬灭和受体荧光发射的增加[21]。FRET已发展成为A、B、E、F型肉毒毒素高通量检测的方法，各血清型毒素作用于其特异性底物导致底物荧光性发生变化而被检测。该方法通常使用一条两端有标记的寡肽模仿天然底物，一个荧光受体分子连接在一侧末端，一个荧光供体连接在另一末端，荧光共振能量从供体转移到受体仅发生于底物肽未断裂、两端标记都完整并彼此极为邻近时。当毒素作用时底物肽断裂，两侧标记被分隔开，因此阻断了荧光能量的转移，FRET现象也随之消失。荧光共振能量的减少直接与肉毒毒素浓度成比例[2]。与ELISA相比，FRET的最大优点是能够检测活性毒素。Joshi[22]比较了FRET的2种底物SSA[23]和SNAPtide在检测BoNT/A时的灵敏度，发现采用SSA检测的灵敏度比SNAPtide（150 ng/mL）提高一个数量级，检测血浆样本中BoNT/A检测限为15 ng/mL；此外，采用SSA为底物可筛选BoNT/A轻链的突变株，因此可用于区分生物学功能和非生物学功能的BoNT/A轻链。

2.5 细胞学检测法（cell-based assays）

细胞学检测法是模拟活体中毒的体外检测方法，它能在体外较好地模拟活体中毒。该方法有望成为小鼠生物试验法的替代方法，并且是近年来的研究热点[24]。细胞试验法常用的细胞有传代细胞系如neuro-2a、PC12和SK-N-SH细胞，或者使用来源于鸡、小鼠的原代神经元细胞和小鼠、大鼠脊髓细胞[25]。细胞内肉毒毒素活性的检测可通过蛋白质印迹分析法检测靶蛋白的裂解产物，另外可通过特异性荧光共振能量转移法检测或神经元活性测定。采用传代细胞系的检测方法在临床样本肉毒毒素活性测定中灵敏度相对不足，但采用制备的原代神经元细胞检测，其灵敏度与小鼠生物试验法（10 pg/mL）近似[26]。细胞试验法也存在一些缺点，如耗时长、试验流程复杂、需要组织或细胞培养设备。

2.6 肽链内切酶质谱法（Endopep-MS assay）

肽链内切酶质谱法是一种快速且灵敏的检测方法，不仅能测定毒素的活性，还可以确定肉毒毒素的血清型[27]。该方法以毒素的蛋白水解酶活性为基础，不同的肉毒毒素血清型在其特异的位点酶切特定的底物肽段，例如BoNT/A在SNAP-25蛋白的Q197和R198两个氨基酸残基之间进行酶切[28]。通过质谱检测质量特异的酶切产物可以确定肉毒毒素血清型，克服了传统ELISA检测方法中不同血清型具有交叉反应的缺点。底物肽段可模仿肉毒毒素在体内的靶标SNAP-25或突触小泡蛋白2的氨基酸序列组成[27]。一般采用基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-MS）或电喷雾离子源质谱（ESI-MS）进行检测。肽链内切酶质谱法能在不同的样本基质中检测肉毒毒素，检测限低于小鼠生物试验法。就A、B、E、F型肉毒毒素而言，内切酶质谱法对于血清样本的检测限为0.05～0.5 MLD50/mL。

内切酶质谱法主要通过优化底物肽段和优化临床样品前处理提高检测灵敏度，特定的底物肽段对肉毒毒素的亲和力以及肉毒毒素对底物肽段的酶切效率直接影响产物肽段的量，进而影响检测灵敏度。目前，大多数研究采用MALDIMS检测，Barr等[29]选取BoNT/A原始底物SNAP-25的185～206位氨基酸残基组成的肽段进行修饰，通过底物肽末端修饰，内部氨基酸替代[30]，肽段长度适当延伸和酶切位点附近氨基酸替换[31]等策略提高BoNT/A检测灵敏度。值得注意的是，一些临床样本如粪样中存在的高浓度非特异内源性蛋白或蛋白酶，会导致干扰背景并降低内切酶质谱法检测的灵敏度，因此需要采取一些前处理降低样品中杂质蛋白的干扰。例如采用高亲和力抗体偶联免疫磁珠捕获毒素[32]，采用高浓度钠盐洗涤磁珠-毒素复合物并加入蛋白酶抑制剂，能够有效减少样品中的蛋白酶[33]。通过一系列优化，MALDI-MS检测BoNT/A的灵敏度可达0.1 MLD50/mL（血浆）和0.2 MLD50/mL（粪样）。目前采用ESI-MS检测BoNT的文献并不多，但ESI-MS在定量准确性及数据重现性等方面有极大的优势，检测BoNT灵敏度高且特异性强，仅需数小时即可完成。该方法亦可通过优化底物肽段等策略提高检测灵敏度，例如Rosen等[34]采用优化的底物肽189RTRIDEGNQRATR（Nle）LG204检测血浆样品中的BoNT/A，灵敏度可达0.1 MLD50/mL。此外，ESI-MS还可在毒素-底物酶切反应体系中同时检测不同血清型的BoNT，减少所需样品体积并节约检测时间，Rosen等[34]将 BoNT/A、BoNT/B、BoNT/E 3种毒素特异的底物肽混合，单次反应即可同时检测血浆样品中的3种毒素，BoNT/B、BoNT/E的检测灵敏度与BoNT/A相当。

作为有力的毒素分析确证技术，内切酶质谱法已成为近年来肉毒毒素检测的研究热点，但其需要昂贵的质谱仪、繁琐的样品前处理和专业的数据分析，在大规模临床样品中的应用有待进一步验证。随着质谱仪小型化和各种新型离子源质谱的快速发展，内切酶质谱法有望成为广泛应用的肉毒毒素检测方法。

3 展望

肉毒毒素是一种高毒性和最具威胁的生物恐怖战剂，在临床应用和可疑的肉毒毒素食物中毒检测中，需要灵敏度高和血清型特异性的检测方法。小鼠生物试验法是肉毒毒素检测的“金标准”，但耗时长、非自动化操作、需要使用动物等使其应用受到限制。目前，肉毒毒素体外检测方法取得了显著进步，例如改进后的ELISA法和FRET法能够检测活性和非活性的神经毒素，在肉毒毒素功能研究中已有很大进展，一些细胞学检测法相比于小鼠生物试验法，检测灵敏度更高。肽链内切酶质谱法由于具有较高的灵敏度、血清型特异性和能够检测毒素活性，得到越来越广泛的应用，其检测方法的成功建立对同类神经毒素的检测具有极大的借鉴意义，例如内切酶质谱法可拓展应用于其他蛋白水解酶毒素（如破伤风毒素）的检测。当然，本文所提及的方法都需要进一步优化，以及应用于食品样品、临床样品和环境样品的深入验证。质谱技术的快速发展，尤其是ESI-MS的强大分析能力，结合新型的生物传感器和多样化的技术，有望发展出更加理想的肉毒毒素检测方法。