重组蜥蜴利什曼原虫载体疫苗的研制现状

李文桂，陈雅棠

重庆医科大学附属第一医院 传染病寄生虫病研究所，重庆 400016

蜥蜴利什曼原虫（Leishma niatarentolae，Lt）是一种低等真核生物，介于原核和真核之间，可在26℃、低廉的培养基中，以前鞭毛体的形式进行培养，可忍耐高密度的细胞培养，倍增时间短（5～6 h），可产生高水平蛋白（0.1～30mg/L），这些蛋白可贮存在胞浆内或分泌至培养基中。Breton等[1]将5×107蜥蜴利什曼原虫的前鞭毛体腹腔注射BALB/c鼠，免疫后4周发现免疫鼠的脾细胞增殖，分泌高水平IFN-γ，但不分泌IL-4，免疫后6周静脉注射5×107杜氏利什曼原虫（L.donovani）的前鞭毛体进行攻击，攻击后4周发现免疫鼠肝脾的寄生虫负荷降低，提示用蜥蜴利什曼原虫进行接种可诱导小鼠产生一定的保护力。

蜥蜴利什曼原虫有36条染色体，通常缺乏GP63、LPG3和A2等毒力因子，可感染人和鼠，但对人体无致病性。它具有原核的基因表达体系和真核的蛋白折叠与修饰体系，有独特的RNA编辑方式，所有内源mRNA加上1段35个核苷酸的先导序列，能被虫体特异的反义核酸所阻断。Pirdel等[2]认为它可作为一种新型疫苗载体。Ta⁃heri等[3]报道了一种利什曼原虫-大肠埃希菌穿梭表达载体pLEXSY，该载体含有1.7kb的基因间区域（intergenicregion，IR），可在IR内插入外源基因，外源基因可被载体内部的RNA聚合酶Ⅱ识别和转录，因此可低水平表达外源蛋白；可以通过增加抗生素的浓度排除低拷贝数目的细胞，从而提高蛋白的表达水平。大量研究表明蜥蜴利什曼原虫作为疫苗载体可表达婴儿利什曼原虫、硕大利什曼原虫、刚地弓形虫、人类免疫缺陷病毒1型、人乳头瘤病毒16型、丙型肝炎病毒等，本文拟就这方面的研制现状做简要综述。

1 蜥蜴利什曼原虫介导的婴儿利什曼原虫疫苗

1.1 重组Lt-A2疫苗

婴儿利什曼原虫（L.infuntum）可引起内脏利什曼病，俗称黑热病。A2蛋白存在于利什曼原虫的无鞭毛体内，含有10个氨基酸的重复序列，随着不同程度的重复，相对分子质量可为45000～110000，在利什曼原虫靶向内脏的过程中起重要作用。Mizbani等[4]以pKSNEO-A2为模板扩增154bp的A2基因，插入pNEO-GFP得pNEO-GFPA2；将其电穿孔转化蜥蜴利什曼原虫的TarⅡ株，筛选培养重组寄生虫，Northern印迹显示A2基因插入重组寄生虫的基因组，免疫印迹显示黑热病患者血清识别重组寄生虫表达的45000的A2蛋白；将5×106重组寄生虫腹腔注射BALB/c鼠，免疫后6周发现免疫鼠的血清IgG和IgG1升高，脾细胞分泌高水平的IFN-γ，此时静脉注射1×107婴儿利什曼原虫的前鞭毛体进行攻击，在攻击后4周用实时荧光定量PCR检测，发现免疫鼠的肝脾寄生虫负荷显著降低。

1.2 重组Lt-A2-CPA-CPB疫苗

婴儿利什曼原虫的半胱氨酸蛋白酶（cyste⁃ineproteinase，CP）A/B（CPA/CPB）的相对分子质量为24000，可参与利什曼原虫自噬体的形成，在前鞭毛体向无鞭毛体的转化过程中起重要作用。Rafati等[5-8]的研究表明重组CP蛋白加弗氏佐剂或混合质粒pCB6-CPA和pCB6-CPB腹腔注射BALB/c鼠均可有效对抗1×106婴儿利什曼原虫的前鞭毛体攻击，提示重组CP是较好的疫苗候选分子。由于宿主MHC分子的多样性和利什曼原虫抗原结构的复杂性，宿主将针对抗原的多个表位产生免疫反应，使得单一抗原成分诱导宿主产生的保护性免疫应答效果往往较低，因此，将A2抗原和CPA-CPB抗原的编码基因连接起来可能是一条较好途径。Saljoughian等[9]将pEGFP-A2-CPA-CPB与pLEXY-neo2重组得pLEXSY-EGFPA2-CPA-CPB，将其电穿孔转化蜥蜴利什曼原虫的TarⅡ株，筛选培养重组寄生虫；流式细胞仪检测表明重组寄生虫可表达EGFP-A2-CPA-CPB融合蛋白，免疫印迹发现黑热病患者血清识别重组寄生虫表达的相对分子质量为103000的融合蛋白；将50μgpCD-A2-CPA-CPB肌肉注射BALB/c鼠，首次免疫后3周静脉注射2×107重组寄生虫进行加强，在首次免疫后6周发现免疫鼠的血清IgG1和IgG2a升高，IgG1/IgG2a比值大于1，免疫鼠的脾细胞分泌高水平IFN-γ、IL-2和NO，但不分泌IL-10，此时静脉注射107婴儿利什曼原虫的前鞭毛体进行攻击，攻击后8周发现免疫鼠的肝脾病理变化明显减轻，寄生虫负荷显著下降。Shah⁃bazi等[10]将2×107重组寄生虫皮下注射比格犬，首次免疫后3周加强1次，首次免疫后6周发现免疫犬的血清IgG2a升高，外周血单核细胞分泌高水平的IFN-γ和TNF-α，但不分泌IL-10，此时静脉注射4×107婴儿利什曼原虫的前鞭毛体进行攻击，攻击后18个月用实时荧光定量PCR检测，发现免疫犬骨髓的寄生虫负荷明显降低。

1.3 重组Lt-KMP11-NTGP96疫苗

婴儿利什曼原虫的动基体膜蛋白11（kineto⁃plastid membrane protein 11，KMP11）是一种高度保守的膜表面蛋白，在前鞭毛体和无鞭毛体均有表达，可促进T细胞产生IFN-γ。Bhaumik等[11]将100μgpCMV-KMP11-IL-12肌肉注射BALB/c鼠可诱导Th1和Th2型混合性免疫应答，并可有效对抗1×106杜氏利什曼原虫的前鞭毛体攻击。婴儿利什曼原虫的N端糖蛋白96（N-terminalglyco⁃protein96，NTGP96）属于 HSP90家族，可参与蛋白质的折叠和聚集，具有较强的佐剂活性。Nasiri等[12]以婴儿利什曼原虫的基因组DNA为模板分别扩增279bp的KMP11和1014bp的NTGP96基因，将其融合为1293bp的KMP11-NTGP96基因，插入 pJET1.2得 pJET-KMP11-NTGP96，与 pLEX⁃SY-neo2重组得pLEXSY-KMP11-NTGP96；将其电穿孔转化蜥蜴利什曼原虫的TarⅡ株，筛选培养重组寄生虫；以从重组寄生虫体内抽提的基因组DNA为模板进行PCR可扩增出1293bp的KMP11-NTGP96融合基因，免疫印迹表明黑热病患者血清识别重组寄生虫表达的相对分子质量为54000的KMP11-NTGP96融合蛋白；将2×107重组寄生虫皮下注射BALB/c鼠，首次免疫后4周发现免疫鼠的血清IgG2a、IgG1升高，IgG2a/IgG1比值小于1，免疫鼠的脾细胞分泌高水平IFN-γ和低水平的IL-4，此时腹腔注射107婴儿利什曼原虫的前鞭毛体进行攻击，攻击后4周发现免疫鼠的脾脏寄生虫负荷下降2个数量级。

2 蜥蜴利什曼原虫介导的硕大利什曼原虫疫苗

2.1 重组Lt-CPA-CPB疫苗

硕大利什曼原虫（L.major）可引起皮肤利什曼病，俗称东方疖。Zahedifard等[13]以pCB6-EGFPCPA-CPB为模板扩增2.3kb的EGFP-CPA-CPB基因，插入pLEXSY-neo2得到pLEXSY-EGFPCPA-CPB；将其电穿孔转化蜥蜴利什曼原虫的TarⅡ株，用50μg/mLG418筛选培养重组寄生虫；以从重组寄生虫提取的总RNA为模板进行RT-PCR可扩增出EGFP-CPA-CPB融合基因，Southern印迹证实融合基因插入重组寄生虫的基因组；将1×107重组寄生虫腹腔注射BALB/c鼠，首次免疫后2周加强1次，首次免疫后6周发现免疫鼠的血清IgG2a和IgG1升高，IgG2a/IgG1比值大于1，免疫鼠的脾细胞分泌高水平IFN-γ、IL-2、TNF-α和IL-4，IFN-γ/IL-4比值升高，此时足垫皮下注射2×105硕大利什曼原虫的前鞭毛体进行攻击，攻击后10周发现免疫鼠的足垫肿胀明显减轻，淋巴结的寄生虫负荷下降2个数量级。

2.2 重组Lt-PpSP15疫苗

静食白蛉的唾液蛋白15（Phlebotomus papata⁃sisalivary protein15，PpSP15）是一种有效的免疫分子。Katebi等[14]将397bp的PpSP15基因插入pEGFP-N3得pEGFP-PpSP15，与pLEXSY-neo重组得pLEXSY-PpSP15；将其电穿孔转化蜥蜴利什曼原虫的TarⅡ株，筛选培养重组寄生虫；以从重组寄生虫抽提的基因组DNA为模板进行PCR可扩增出397bp的PpSP15基因，免疫印迹表明东方疖患者血清识别重组寄生虫表达的42000的EGFP-PpSP15蛋白；将2×107重组寄生虫加CPG佐剂皮下注射免疫BALB/c鼠，首次免疫后3周加强1次，首次免疫后6周发现免疫鼠的血清IgG2a/IgG1比值大于1，脾细胞分泌高水平IFN-γ、TNF-α和IL-17和低水平的IL-5，此时皮下注射2×105硕大利什曼原虫的前鞭毛体进行攻击，攻击后11周用实时荧光定量PCR检测发现免疫鼠淋巴结的寄生虫负荷显著降低，足垫肿胀明显减轻。

2.3 重组Lt-LPG3疫苗

脂磷酸多糖 3（lipophosphoglycan，LPG3）基因编码的内质网伴侣分子GRP94属于HSP90家族，可参与抗原提呈，蛋白质折叠、融合和分泌，具有一定的免疫原性。Pirdel等[2]将2316bp的LPG3基因插入pTZ57R得pTZ-LPG3，与pLEXSY-hyg2重组得pLEXSY-LPG3；将其电穿孔转化蜥蜴利什曼原虫的TarⅡ株，筛选培养重组寄生虫；免疫印迹发现东方疖患者血清识别重组寄生虫表达的97000的LPG3蛋白，但未进行保护力试验。

3 蜥蜴利什曼原虫介导的刚地弓形虫疫苗

刚地弓形虫（Toxoplasmagondii，Tg）可引起弓形虫病，其表膜存在表面抗原（surface antigen，SAG），其中SAG1（P30）是一种主要的表面抗原，仅在弓形虫的速殖子阶段表达，主要参与弓形虫早期入侵过程，张洪花等[15]将20μg纯化的P30组分抗原加弗氏佐剂腹腔注射昆明种小鼠，初次免疫后2、4周加强2次，初次免疫后5周腹腔注射300个弓形虫RH株的包囊进行攻击，发现免疫组存活时间比对照组延长1.2d。Peterson等[16]将20μg重组SAG1抗原加氢氧化铝佐剂皮下注射NMR1鼠，初次免疫后2、4和6周加强3次，初次免疫后8周皮下注射100个弓形虫RH株的包囊进行攻击，攻击后50d发现免疫组的存活率为44.4%（4/9），而对照组为 20%（1/5）。龚娅等[17]将5μg重组质粒pCD-P30肌肉注射免疫BALB/c鼠，初次免疫后2周加强1次，发现免疫鼠的血清IgG在初次免疫后2～6周增加，初次免疫后6周达较高水平。这些研究说明P30抗原是一种较好的免疫分子。许越等[18]以弓形虫RH株基因组DNA为模板扩增957bp的P30基因，插入pMD18-T得pMD18-P30，与pLEXSY-neo重组得pLEXSY-P30；将其电穿孔转化蜥蜴利什曼原虫的TarⅡ株，筛选阳性虫株，培养7d，SDS-PAGE证实重组虫株能够表达相对分子质量为33000的P30蛋白，保护力试验正在进行中。

4 蜥蜴利什曼原虫介导的HIV-1疫苗

人免疫缺陷病毒1型（Human immunodeficien⁃cy virustype1，HIV-1）是获得性免疫缺陷综合征的病原体。其gag基因编码一个蛋白前体P55，经蛋白酶裂解后形成衣壳蛋白P24、核衣壳蛋白P7和内膜蛋白P14，主要参与HIV-1的感染和复制。Breton等[19]以pNL4.3为模板扩增1.6kb的gag基因，插入pSPα-Pro-Neo得pNeo-gag；将其电穿孔转化蜥蜴利什曼原虫的TarⅡ株，筛选培养重组寄生虫；免疫印迹发现艾滋病患者血清识别重组寄生虫表达的55000的Gag蛋白；将5×107重组寄生虫腹腔注射BALB/c鼠1次，发现免疫鼠的血清IgG在免疫后2～12周升高，免疫后8周达较高水平，免疫鼠的脾细胞在免疫后2～12周明显增殖，免疫后12周达较高水平，ELISpot证实免疫鼠的脾IFN-γ+SFCs数目在免疫后2～12周增加，在免疫后2周达较高水平。

5 蜥蜴利什曼原虫介导的HPV16疫苗

5.1 重组Lt-E7疫苗

人乳头瘤病毒16型（Human papillomavirus type16，HPV16）与人宫颈癌的发生密切相关。HPV16的E7蛋白是一种DNA结合蛋白，可干扰抑癌蛋白RB与转录因子E2F和P107的结合，使细胞周期发生紊乱，E7蛋白还可与P103、周期蛋白A和CDK2等细胞周期相关因子结合，使细胞发生癌变。Salehi等[20]将HPV16的E7基因插入pEGFPN1得pEGFP-E7，与pDrive重组得pDrive-EGFP-E7，与pLEXSY-neo重组得pLEXSY-EGFPE7；将其电穿孔转化蜥蜴利什曼原虫的TarⅡ株，筛选培养重组寄生虫；以从重组寄生虫抽提的基因组DNA为模板进行PCR可扩增出1kb的融合基因，免疫印迹发现宫颈癌患者血清识别重组寄生虫表达的39000的EGFP-E7融合蛋白；将100 μgpCD-E7皮下注射C57BL/6鼠，首次免疫后3和6周皮下注射2×107重组寄生虫进行加强，首次免疫后9周发现免疫鼠的血清IgG2a升高，脾细胞分泌高水平IFN-γ，但不分泌IL-5，此时皮下注射5×106肿瘤细胞株TC-1进行攻击，攻击后2个月发现免疫组的肿瘤面积显著小于对照组。

5.2 重组Lt-L1疫苗

HPV16的L1蛋白是主要衣壳蛋白，可自身聚合成病毒样颗粒（virus-likeparticles，VLP）。Bol⁃hassani等[21]将 pGEM-L1 与 pLEXSY-1-blecherry3重组得pLEXSY-L1，将其电穿孔转化蜥蜴利什曼原虫的TarⅡ株，用50μg/mL博莱霉素筛选培养重组寄生虫；以从重组寄生虫抽提的基因组DNA为模板进行PCR可扩增出1515bp的HPV16L1基因，免疫印迹表明宫颈癌患者血清识别重组寄生虫表达的60000的L1蛋白；将10μg源自重组寄生虫的L1蛋白腹腔注射C57BL/6鼠，首次免疫后2和4周加强2次，发现免疫鼠的血清IgG和IgG2a在首次免疫后3～6周即可达到较高水平。

6 蜥蜴利什曼原虫介导的HCV疫苗

丙型肝炎病毒（Hepatitis Ccirus，HCV）是丙型肝炎的病原体，E2412-415是HCVE2糖蛋白的合成肽。乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus，HBV）是乙型肝炎的病原体，其基因组的S区基因分为前S1、前S2和S区，分别编码包膜上的前S1、前S2蛋白和乙型肝炎表面抗原（hepatitisBsurfaceantigen，HBsAg），三者合称大分子蛋白，前S2蛋白和HBsAg合称中分子蛋白，HBsAg称小分子蛋白，大中小分子蛋白的相对分子质量分别为39000、33000和24000。前S1和前S2蛋白在HBV感染肝细胞时起重要作用。SHBsAg是HBV的小表面抗原。Czarnota等[22]将HCV E2412-425表位与HBV和SHBsAg基因融合后，插入pLEXSY-1-blecherry3得pLEXSY-E2-SHBsAg，将其电穿孔转化蜥蜴利什曼原虫的TarⅡ株，筛选培养重组寄生虫；免疫印迹发现丙型肝炎患者血清识别重组寄生虫表达的30000的融合蛋白；将15μg源自重组寄生虫的融合蛋白腹腔注射BALB/c鼠，首次免疫后2和4周加强2次，首次免疫后6周发现免疫鼠的血清IgG升高，ELISpot表明免疫鼠的脾IFN-γ+SFCs数目显著增加。

7 结语

重组蜥蜴利什曼原虫疫苗作为一种新型疫苗具有下述优点：对人体无致病性；培养价格低廉，产量高（可达30mg/mL）；无内毒素污染；可进行转录后修饰和重要的糖基化；能模拟自然感染过程，自发传递抗原，促进APC提呈抗原，优先活化CD4+T细胞，传递完整的抗原谱，增强免疫系统的记忆；在宿主体内长期存在，在感染发生时，迅速产生特异性免疫应答和记忆性T细胞，表达的外源蛋白具有高度的生物学活性。

不可否认的是重组蜥蜴利什曼原虫疫苗尚存在下述缺点：阳性寄生虫株的筛选需要较长时间；前鞭毛体和无鞭毛体表达外源蛋白可能存在不同；可供选择的表达载体较少；本身所含有的抗生素抗性基因可能对人体有害；疫苗与宿主之间的相互作用机制研究尚不深入；疫苗效果的标准化和规范化评价体系尚未建立；表达产物与天然蛋白存在较大差异；表达产物可能对阳性寄生虫株有害；表达蛋白的水平较低等。

重组蜥蜴利什曼原虫疫苗是一种新型疫苗，用于感染性疾病和肿瘤的防治及利什曼原虫化疗药物的筛选，应具有十分广阔的前景。但将重组蜥蜴利什曼原虫疫苗发展成为一种理想疫苗亟待解决下述问题：疫苗表达蛋白的翻译后修饰及调控；疫苗的免疫途径、剂量、次数和间隔次数；疫苗高效启动子；疫苗新的选择标志；重组多价蜥蜴利什曼原虫疫苗；疫苗免疫机制等。相信随着这些问题的阐明，重组蜥蜴利什曼原虫疫苗用于临床疾病的免疫治疗指日可待。

参考文献