汉滩病毒新型疫苗研究进展

董兆昱，郭雷鸣，程林峰

空军军医大学基础医学院 微生物学教研室，陕西 西安 710032

汉滩病毒（Hantaan virus，HTNV）在我国主要引起肾综合征出血热（hemorrhagic fever with re⁃nal syndrome，HFRS），是由鼠类传播的一种急性病毒性传染病[1]，临床上以发热、出血、急性肾功能损害和免疫功能紊乱为主要特征[2]。HFRS流行于世界上近40个国家和地区，我国是HFRS疫情最严重的国家之一，主要表现在流行范围广、发病人数多、病死率较高。HFRS的传染源和宿主动物广泛，传播途径多样，主要危害青壮年，临床上尚无特异有效的治疗药物，因此在我国HFRS的防治任务十分艰巨。

目前我国已研制出HTNV灭活疫苗，其推广使用对预防HFRS的发生和流行起到了积极作用。但该类疫苗仍存在一些问题，主要是不能有效刺激细胞免疫应答，诱导机体产生中和抗体的能力也较弱，抗体滴度不高等，因而研发新型HTNV疫苗成为当务之急。我们仅就近年来国内外HTNV新型基因工程疫苗的研究进展做简要综述。

1 HTNV基因组及其结构蛋白

HTNV颗粒由核心和包膜组成，其基因组位于核心部分，为单股负链RNA。HTNV全基因组由11845个核苷酸组成，包括M、S、L共3个基因片段[3]。M基因全长约3.7kb，只有一个长开放读框（openreadingframe，ORF），长度约 3.4kb，编码2个糖蛋白Gn和Gc的前体蛋白，前体蛋白中部有一个由5个氨基酸残基（WAASA）组成的共翻译切割点，在细胞内质网内将前体蛋白切割成Gn和Gc蛋白，相对分子质量分别为72000和55000[4]。HTNV的Gn和Gc的结构和功能决定了病毒的生物学特性，因此成为当前最受关注的研究热点。Schmaljohn等[5]发现HTNVGP上共有7个N糖基化位点，其中Gn上有5个天门冬酰胺连接的糖基化位点，Gc上有2个；研究还发现Gn和Gc上分别含有3个和1个保守型糖基化位点，这些糖基化位点对于维持病毒的生物学特性至关重要。HTNV的Gn和Gc上存在诸多中和抗原位点和血凝抗原位点，能刺激机体产生中和抗体，对感染动物和HFRS患者有保护作用，因此成为HFRS基因工程疫苗研究的重要抗原蛋白[6]。徐志凯等[7]采用多株单克隆抗体（monoclonalanti⁃body，mAb）对HTNV的结构蛋白进行分析时发现，GP上不仅存在独立的中和抗原位点和血凝抗原位点，也存在一些具有双重功能的位点。

S基因全长约1.7kb，包含一个长ORF，长度约1.3kb，编码相对分子质量约为50000的非糖基化蛋白NP[8]。HTNVNP的主要功能是包裹病毒基因组，该蛋白C端的高度保守序列可识别病毒基因组非编码区基因并与之结合形成复合体，该复合体与RNA聚合酶一起组成病毒颗粒的核心。HTNVNP上含有多个特异性抗原位点。徐志凯等[7]采用10株mAb对HTNVNP做抗原位点分析时，发现NP上至少有12个抗原位点，其中7个组特异性抗原位点和1个亚组特异性抗原位点主要分布在2个区域内，其他抗原位点则可能与上述抗原位点的分布有部分相同或重叠，这些抗原位点的重叠有些表现在一级结构上，有些则表现在空间结构上[9]。HTNVNP具有很强的免疫原性，可以诱导机体产生强烈的细胞和体液免疫应答，所以也成为HTNV新型基因工程疫苗研究中的重要抗原蛋白。

L基因全长约6.4kb，非编码区较短，为36～43 bp，含有一个长ORF，编码病毒RNA依赖的RNA聚合酶，相对分子质量约250000，与病毒复制和转录有关，并非病毒的结构蛋白[10]。HTNVRNA聚合酶分子很大，很难在大肠杆菌等表达系统中表达，所以目前关于其生物学活性的研究很少。

2 HTNV亚单位疫苗

亚单位疫苗是指在原核或真核细胞中表达保护性抗原基因，并将表达产物（蛋白质或多肽）制成疫苗。其优点在于安全性和稳定好，纯度比较高，便于大规模生产。

多项研究表明，利用大肠杆菌表达系统[11-12]、酵母表达系统[13-14]和杆状病毒表达载体系统（baculovirus expression vector system，BEVS）[15-16]等均可表达HTNV的NP或GP，并具有较强的抗原性，免疫动物后也取得了良好的保护效果。Figueiredo等[17]通过大肠杆菌BL21构建了能表达HTNVNP的重组原核表达载体，将表达的NP免疫小鼠后，在其血清中可以检测到针对NP的特异性抗体，证明表达的NP可作为HTNV的抗原蛋白加以研究和利用。Petraityte等[13]利用酿酒酵母表达系统稳定地大量表达了HTNVNP，将其用于ELISA检测HFRS患者血清中的抗HTNVIgG和IgM抗体，特异性和准确性分别达98%和99%，证明表达的NP具有良好的抗原性。Yoshimatsu等[18]用BEVS表达了HTNVNP和GP，将表达的NP或GP免疫小鼠后收集其血清或脾细胞并注射入小白鼠乳鼠，结果发现可以部分保护乳鼠抵抗致死性的HTNV攻击。Schmaljohn等[19]利用BEVS分别表达HTNV的NP和GP以及单独表达Gn和Gc，并对其免疫学特性进行研究，结果证实所有表达的重组抗原蛋白均能有效刺激机体产生特异性免疫应答，并且全GP蛋白的免疫效果要强于Gn和Gc单独免疫的效果，动物保护实验发现所有抗原蛋白对乳鼠均有全部或部分抗HTNV攻击的保护作用。Yoon等[11]发现大肠杆菌中表达的全长或截短的HTNVNP在体外被酪蛋白激酶Ⅱ（casein kinase，CKⅡ）磷酸化，位点特异性诱变研究表明HTNVNP磷酸化可能发生在位点直接诱变的位置以外的未知位点。Ma等[20]通过IEDB（表位预测和分析工具最全面的集合）选择15个8-mer肽，用IFN-γELISpot测定，在HTNV感染的小鼠的脾细胞中鉴定出新的GP衍生的CTL表位GP6 aa456～aa463，ELISPOT和细胞介导的细胞毒性测定显示该肽疫苗在免疫小鼠中诱导强的IFN-γ应答和有效的细胞毒性H2-Kb限制性CTL表位，表明HTNV亚单位疫苗具有临床应用价值。Ma等[42]发现FA9（HTNV核蛋白CD8+T细胞表位aa129～aa137）与 HLA-A*0201复合物显示典型的MHCⅠ类折叠，诱导Tg小鼠IFN-γ、TNF-α、粒酶B和CD107a的高表达水平，表明FA9可以用于开发HTNV肽段疫苗。

虽然目前关于HTNV亚单位疫苗的研究取得了长足进展，但也遇到了一些瓶颈问题，例如如何提高HTNV抗原蛋白尤其是GP的表达量，如何有效分泌和正确修饰重组抗原蛋白，如何纯化并保持抗原蛋白活性，以及如何增强其刺激机体的免疫应答能力等。若能有效解决这些问题，将会大大促进HTNV亚单位疫苗的进一步发展。

3 HTNV核酸疫苗

核酸疫苗又称为DNA疫苗或基因疫苗。通常以质粒DNA为基础，即将抗原基因克隆入质粒DNA构建重组质粒，该重组质粒可以在真核细胞中表达相应抗原，其在体内的抗原提呈过程与病毒感染相似，因此能够刺激机体产生特异性的免疫应答，尤其是以CTL杀伤功能为主的细胞免疫应答。同时由重组质粒编码的蛋白抗原在体内可以维持更长效的免疫刺激，能够有效地预防病毒等引起的传染病。核酸疫苗的制备工艺简单，易于保存，同时可以避免出现毒力返祖、人群之间传染及污染环境等危险，安全性高，因此成为研发病毒疫苗的有效策略[19]。

Hooper等[21]将HTNV的M全长基因克隆入pWRG7077表达载体构建了重组核酸疫苗，用基因枪注射仓鼠后，可以有效保护仓鼠免受HTNV的攻击，而且这些免疫仓鼠还可以抵抗同样引起HFRS的汉坦病毒属的另外2个型别的病毒，即多布拉伐-贝尔格莱德病毒（Dobrava-Belgradevi⁃rus，DOBV）和汉城病毒（Seoulvirus，SEOV）的攻击；将该重组核酸疫苗免疫恒河猴，可在猴血清中检测到高滴度的中和抗体，这也是首次关于HTNV核酸疫苗免疫灵长类动物的研究报道。张芳琳等[22]用真核表达载体pcDNA3.1构建了含有HTNVGc和S0.7kb基因的嵌合重组核酸疫苗并用其免疫小鼠，结果在小鼠血清中可检测到针对Gc和NP的高滴度的特异性抗体以及低滴度的中和抗体，同时发现免疫小鼠的T淋巴细胞增殖能力强于正常小鼠，表明所构建的嵌合重组核酸疫苗可以有效刺激机体的体液免疫和细胞免疫应答。Woo等[23]利用真核表达载体pcDNA3.1构建了含有HTNVNP的重组核酸疫苗，免疫C57BL/6小鼠后可以刺激其产生针对NP的特异性抗体以及NP特异性的CD8+T细胞应答，并可以保护小鼠免受HTNV的攻击。Jiang等[24]通过特异性抗体检测和微量细胞中和实验，以及IFN-γELISpot和CTL毒性杀伤实验来评估BALB/c小鼠对基于Gn的DNA疫苗的免疫应答，发现该DNA疫苗可以刺激机体产生较强的细胞和体液免疫应答，且疫苗具有长期保护作用。

此外，多个研究小组还研究了不同型别的汉坦病毒的核酸疫苗，包括 HTNV[15,21,23]、SEOV[25-26]、PUUV（Puumalahantavirus）[27]、ANDV（Andesvi⁃rus）[28-29]与 SNV（Sin Nombre hantavirus）[30-31]，这些研究显示构建的核酸疫苗在仓鼠、小鼠或猕猴等实验模型中均能诱导特异性的体液免疫应答，并对动物具有保护作用。因此，有研究者试图通过将这些重组核酸疫苗进行混合来研发HFRS多价疫苗。然而，Spik等[32]发现，将HTNV和PUUV的核酸疫苗通过基因枪分别注射小鼠时，可以刺激产生分别针对HTNV和PUUV的特异性抗体应答，但是将二者混合后注射小鼠时仅能刺激产生针对PUUV的特异性抗体应答，他们认为这可能是不同的核酸疫苗之间存在相互干扰所致。Bou⁃dreau等[33]进一步研究发现，当通过肌肉电转的方式接种混合疫苗时可以减少这种干扰，免疫后小鼠体内可以检测到分别针对HTNV和PUUV的特异性抗体应答。关于基因枪注射与肌肉电转在应用于核酸疫苗免疫时的孰优孰劣还须更深入的研究。McCoy等[34]发现HTNV与PUUV核酸疫苗单独或作为组合通过多头皮内电穿孔装置注射，不需要预先筛选组合疫苗，可以减轻递送时的负面效应，降低免疫应答的风险。

4 HTNV病毒活载体疫苗

病毒活载体疫苗是指将外源目的基因片段重组于病毒载体中，重组后的病毒载体导入机体后即可表达目的蛋白，通过刺激机体产生特异性的免疫应答来达到预防某种疾病的目的。这类疫苗的优点是安全性好，技术较为成熟。目前常用的病毒载体主要包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体及痘苗病毒载体等。

多项研究证实用HTNV重组活载体疫苗免疫后的动物可以有效抵抗HTNV的攻击。Chu等[35]将编码HTNVGP和NP的基因克隆到痘苗病毒载体中构建重组痘苗病毒，用其免疫地鼠后可产生针对HTNV的中和抗体；再用HTNV攻击免疫后的地鼠，并采用RT-PCR方法检测地鼠肺脏和肾脏中的HTNV核酸，结果均为阴性，表明用HTNV重组痘苗病毒免疫可使地鼠获得有效的保护。Yu等[36]构建了带有HTNVGP和rLV-M的重组假型慢病毒，用rLV-M免疫C57BL/6小鼠，动物保护实验显示该疫苗可有效保护小鼠免受病毒攻击。Cheng等构建含HTNVGn和NP0.7kb片段（NPN端1～274aa）的重组腺病毒并用其免疫C57BL/6小鼠，发现可刺激机体产生有效的体液和细胞免疫应答，中和抗体滴度达1∶40，而灭活疫苗对照组小鼠的中和抗体滴度仅为1∶20；进一步用HTNV攻击免疫后的小鼠，并采用ELISA检测小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑等脏器组织中的病毒特异性抗原，结果均为阴性，表明用HTNV重组腺病毒免疫可使小鼠获得有效的保护[37]。

虽然活载体疫苗可有效刺激机体产生特异性免疫应答，并保护动物免受病毒的攻击，但是其最大的缺点是接受疫苗接种的个体体内预先存在的抗病毒载体抗体会影响活载体疫苗的免疫效果。Schmaljohn等[38]通过构建含有HTNVGP和NP的重组痘苗病毒免疫地鼠和沙鼠后取得了很好的保护效果，但该疫苗后续的Ⅰ期和Ⅱ期临床试验发现，对痘苗病毒抗体阴性的志愿者接种后100%产生了针对HTNV的特异性中和抗体，而先前体内存在痘苗病毒抗体的志愿者接种后仅有50%能产生针对HTNV的特异性中和抗体[39]，再加上活载体疫苗本身潜在的副作用风险，使得该疫苗的研制工作最终搁浅[40]。

5 HTNV病毒样颗粒疫苗

病毒样颗粒（virus-likeparticle，VLP）是由病毒的一种或多种结构蛋白组成的不含病毒核酸的空心颗粒。这些VLP可以自我组装，与天然病毒的空间结构高度相似，因而保持了病毒抗原蛋白的天然构象并具有很好的免疫原性；同时由于不含病毒核酸，不能自我复制，因而不会出现毒力返祖，无感染风险。因此，VLP是研制HTNV基因工程疫苗的一种安全、高效的候选疫苗。

目前关于HTNVVLP疫苗的研究还比较有限，但已有研究表明HTNV的结构蛋白可以自我组装形成VLP，并且具有良好的免疫原性。如Betenbaugh[33]等利用BEVSpFastBacDual分别构建了含有HTNVM及S基因的rBV，将rBV共感染Sf9昆虫细胞制备了HTNVVLP，免疫小鼠后可刺激机体产生较高滴度的中和抗体。Li[35]等利用真核表达载体VH-dhfr/A9构建了含有HTNVM及S基因的重组质粒VH-dhfr/A9M及VH-dhfr/A9S，并通过共转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的方式制备了HTNVVLP，用其免疫小鼠后可以刺激机体产生较强的体液免疫和细胞免疫应答。Cheng[41]等将GPI锚定形式的GM-CSF或CD40L整合到HTNVVLP中以产生嵌合VLP，发现GM-CSF和CD40L掺入HTNVVLP诱导高水平的体液和细胞免疫应答，并保护C57BL/6小鼠免受HTNV攻击。

VLP作为基因工程候选疫苗，不仅仅用于HTNV疫苗的研制，也广泛应用于其他病毒疫苗的研制。目前VLP疫苗研制工作中最关键的问题在于如何大量表达和纯化VLP，因此选择一种合适的表达系统显得尤为重要。

6 结语

综上所述，HTNV新型基因工程疫苗的研究虽然取得了一些进展，但是距离实际应用还相差很远。目前存在的主要问题包括目的蛋白的表达量还不高，各表达系统（产物）刺激机体的免疫应答水平还不理想。因此，进一步筛选和优化组合有效的保护性抗原，进一步选择合适的表达载体并优化表达系统，并联合应用免疫佐剂，以提高目的基因刺激机体免疫应答的能力，都值得深入探索。

参考文献