海洋防污涂料生物评价方法研究进展

张海春，胡建坤，孙保库，陆阿定，郁小芬 （浙江省海洋开发研究院，浙江舟山 316021）

0 引言

海洋污损指的是海洋生物对暴露在海水中物体表面的附着和生长，它对海洋船舶及海洋设施造成巨大的危害，不但会增大船舶摩擦阻力，降低航速，增加燃油消耗，导致轮机老化损坏、涂层破坏、钢材腐蚀，而且还会影响传热、堵塞引水管道，增加设备能耗，引起海中仪器传动机构失灵、信号失真等问题［1-2］。在众多防污技术中，涂装防污涂料是最有效、经济和简便的解决海洋生物污损问题的途径。

防污性是防污涂料最重要的性能指标之一，直接与船舶的维修周期、燃油消耗和海洋环境保护有关。防污涂料进入市场前，都要对其防污性进行评价，目前含杀虫剂的防污涂料仍是防污涂料的主流产品，占据市场90%以上的份额，配方中含有大约30%～60%的杀虫剂，其防污性能的测试方法也以杀虫剂的释放测定为基础，比较有代表性的评价方法是对常用的铜、代森锌、吡啶硫酮锌等防污剂的释放速率进行测定的ISO 15181系列标准、ASTM D 6442、D 6903标准和GB/T 7789—2007《船舶防污漆防污性能动态试验方法》、GB/T 5370—2007《防污漆样板浅海浸泡试验方法》和GB/T 31411—2015《船舶防污漆磨蚀率测定法》等。采用测定防污剂释放率、涂层磨蚀率等数据的方法［3］，先测定防污剂释放率等有关数据，再根据测得的数据与防污性能的对应关系来间接表示防污性能，但单一的防污剂释放率或涂层的磨蚀率数据并不能真实地反映涂料的防污性能，与涂料实际的防污性能可能有一定的差距；采用浅海浸泡的方法尽管能直观地观察防污涂料的性能，但是由于海洋环境的复杂性，也存在着不同海区、不同季节、不同年份的生物多样性造成的可比性较差的缺点，同时挂板周期长，损坏或遗失风险高。这些方法对于防污涂料研究初期大量筛选配方显然是不适用的，寻找并建立防污涂料配方大通量的快速试验方法是防污涂料研究的关键之一。

生物评价，也称生物学评价，是指用生物学方法按一定标准对一定范围内的环境质量进行评定和预测。海洋防污涂料性能的生物评价主要是以污损生物为试验生物，以防污涂料引起的生物体行为、生理活动和生化过程的变化为指标而开展的防污涂料性能的评价。与以防污剂释放率为指标的评价方法相比，生物评价法直接与生物体相互作用，更能反映防污涂料真实的防污性能；与实海挂板的评价方法相比，试验条件可控，不同试验批次的可比性更强。

1 防污涂料性能之生物评价方法的研究进展

海洋生物污损过程大体可分成3个阶段：初期阶段、发展阶段、稳定阶段。污损过程初期阶段：细菌和硅藻分泌黏液，在物体表面形成微生物黏膜；发展阶段：大型污损生物的幼体开始附着，种类和个体数不断增多，群落体积和质量不断增大，演替现象明显，一些个体密度大、生长迅速的种类成为群落的主导物种；稳定阶段：生长期长、个体大的种类充分生长，排挤或覆盖了一些已经附着的中、小型种类，群落种类组成比较复杂且质量较大，随着时间的推移，其结构不会发生很显著的变化［4］。

据统计，世界海洋污损生物约2 000种左右，理想的情况下，应对参与污损过程中各个阶段的所有生物种类——细菌、真菌、微藻、大型藻类和无脊椎动物进行评价，但实际上用于涂料性能生物评价的试验生物一般选取那些易于培养或从海洋中易于采集的污损生物。

1.1 以细菌为试验生物的评价方法

海洋细菌是污损生物膜的重要组成部分，与其分泌的胞外聚合物统称为污损微生物膜，污损微生物膜对大型污损生物的孢子和幼虫的附着起着重要作用。国内外以细菌为试验生物的评价方法主要有纸盘法、玻璃环法、分光光度法和凝胶法。通过测定抑菌环的直径或菌悬液的光密度（OD值）计算抑菌率来表征防污材料的防污性能。

Marhaeni等［5］采用纸盘法研究了海草共生细菌对海洋生物膜形成细菌的防污活性。Hellio等［6］采用玻璃环法研究了16种大西洋沿岸海藻提取物对海洋真菌和革兰氏阳性菌的抑制活性，其中9种具有明显的抑制活性。Marechal等［7］通过微量肉汤稀释法测定两种海洋细菌C. marina和P. haloplanktis的MIC（最小抑制浓度）值，表征了褐藻提取物的防污活性。Holmstrm等［8］采用藤壶无节幼体生存生物测定法研究了海洋细菌——伪造假单胞菌和大肠杆菌在凝胶中细菌固定的方法，发现杜邦聚乙烯醇10%凝胶是最佳基质。

马红圳等［9］以假交替单胞菌与创伤弧菌为试验生物，采用牛津杯法测定了2种防污剂的抑菌性能，采用吸光度法测定了3种防污树脂的抑菌性能。张琦等［10］以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌作为试验生物，通过抑菌圈和最小抑制浓度试验测定了多硫代丙酰胺的抑菌性能，结果与将其作为防污剂的涂料样品1 a期海上挂板的试验结果具有一致性。于晓琳等［11］以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为试验生物，通过测定MIC值表征了5种类辣椒素结构丙烯酰胺化合物的抑菌性能，并将其制备成防污涂料样品进行海上挂板120 d，进一步验证了其防污性能。许凤玲等［12］以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌与枯草芽孢杆菌5种细菌为试验生物，以抑菌率为指标测定了9种苯并异噻哚酮类化合物的抑菌活性。沈明等［13］选用3种优势海洋细菌为试验生物，采用凝胶层模拟防污涂层室内挂板和绘制受试菌OD-t生长曲线计算防污剂的MIC值两种方法评价了5种防污剂的防污效果，两种测试方法得到的结果具有一致性。

此外，荧光素二乙酸酯（FDA）水解法和浊度法也被用于以细菌为试验生物的防污剂评价。

以细菌为试验生物的评价方法，主要是以常见的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为主，它们并不是海洋细菌，不具有代表性，但是具体哪一种细菌在污损过程中起到怎样的作用尚不清楚。因此，继续深入研究污损的过程中，确定细菌参与污损的具体种类、作用机理，然后确定污损表征细菌，进而建立生物评价方法是下一步的重要工作。

1.2 以海洋藻类为试验生物的评价方法

海洋藻类主要包括海洋微藻和大型藻类。微藻是海洋物体表面微生物膜的重要组成部分，在微生物膜的形成过程中起着积极的作用，以微藻为试验生物的测试方法主要是藻类的生长抑制、细胞黏附及强度测试。海洋大型藻类及其孢子在涂层表面的附着、生长对海洋污损的形成同样起着积极的作用，以大型藻类为试验生物的评价方法主要是测试其孢子在污损表面的附着及强度。两者在测试方法上具有相似性，显微观测和叶绿素a的测定是附着测试常用的方法，水流冲击则是附着强度的主要测试方法。

Tsoukatou等［14］以新月细柱藻等3种海洋微藻为试验生物，通过测定叶绿素a表征了海绵代谢产物的防污活性；以石莼等3种海洋藻类为试验生物，通过显微镜观察藻类的附着情况进而计算附着率表征了海绵代谢产物防藻类黏附的性能。Statz等［15］以舟形藻和石莼孢子为试验生物，使用荧光显微镜计数评价了仿生涂层的防附着性能，通过在Finlay等［16］专门设计的水通道中暴露于20 Pa的剪切应力下，评价了2种试验生物在仿生涂层上的附着强度。

刘红等［17］以舟形藻为目标附着生物，通过测定叶绿素a的浓度和显微镜观测附着面积分数，评价了无毒防污涂层的防污效果，研究结果表明，2种评价方法结果相互吻合很好。田斌［18］以新月菱形藻、湛江叉边金藻、三角褐指藻为试验生物，对合成的树脂进行了室内挂片试验，结果表明：新月菱形藻更适合表征附着性的差异。王宝娟［19］以新月菱形藻为试验生物，以藻的生长抑制率作为指标，检测了7种国内外防污涂料对藻类的生长抑制作用，与海上挂板结果比较，两者具有一致性。王惠［20］选取我国近海海域的3种优势藻种（中肋骨条藻、强壮前沟藻、微型原甲藻）作为试验生物，以96 h-EC50为毒性指标，评价了海洋防污涂料样品的生物毒性，结果表明：中肋骨条藻是3种浮游藻类中对涂料样品最敏感的藻种。

Iken等［21］运用计算机辅助运动分析监测了褐藻游动孢子的游泳行为，开发了一个基于孢子游泳行为（方向变化率与游泳速度比值）的实验室生物测定方法，该方法与孢子的附着试验结果相比，反映了藻类孢子的适应性和存活率，适合低浓度筛选具有防污活性的物质。

1.3 以海洋动物为试验生物的评价方法

以海洋无脊椎动物为代表的污损动物是海洋污损过程中危害最大的种类，以其为试验生物的评价方法是防污材料研究的重点，也是研究最多的。海洋无脊椎动物的生物测定方法包括幼虫的游泳行为、流动中的表面行为及附着测试［22］。EC50（半数有效浓度）、LC50（半数致死浓度）是生物测定中常用的指标，LC50/EC50的比值是表征化合物毒性的有效数据，从防污性能角度来看，期望的目标值在远大于1的情况下，仍然抑制附着的低或可忽略毒性的化合物，代表更环保和可接受的抑制溶液［23］。

1.3.1 藤壶

藤壶是世界范围内最主要的污损生物，也是研究最多的污损生物之一。藤壶成体营固着生活，其幼体营浮游生活，幼体阶段包括六期无节幼体和一期金星幼体。金星幼体经短期浮游生活后，选择合适的表面进行附着。用于生物评价的藤壶种类主要考虑易于实验室培养或在自然界易于采集的，主要种类包括纹藤壶、致密藤壶等，研究内容集中在无节幼体毒性测试和金星幼体的附着测试，并建立了详细的测试程序［24-25］，用于天然防污产物生物检测模型。

Sasikumar等［26］通过研究比较藤壶和卤虫幼虫对于5种有毒化合物的LC50发现：藤壶幼虫对于有毒化合物的敏感性要远高于卤虫幼虫，该方法是一种简单、快速、低成本的评价海洋污染物毒性的方法。Rittschof等［24］将藤壶无节幼体和金星幼虫作为防污剂毒性和附着抑制的评价生物，认为藤壶是理想的防污试验生物。Marechal等［7］也采用上述方法研究了褐藻粗提物的防污活性。冯丹青等［27］采用生态学单因子梯度试验方法，进行了白脊藤壶金星幼体的室内培养以及附着基、温度、盐度、幼体密度和幼体低温保存时间等因子分别对白脊藤壶金星幼体附着的影响的研究，确定了其基础试验条件的适宜范围，结果表明白脊藤壶可作为筛选天然海洋防污产物的模型生物。严涛等［28］研究了网纹藤壶幼虫的采集与培养技术，结果表明，网纹藤壶无节幼虫于30 ℃黑暗环境中培养5 d左右即可发育为金星幼虫，可将其在4 ℃条件下贮存备用。江学志等［29］以藤壶金星幼虫作为试验生物，通过体视显微镜观察金星幼虫的存亡并计算幼体死亡率，研究了草甘膦及其丙烯酸树脂的生物毒性。黄英等［30］分析了腺介幼虫阶段藤壶附着变态所受到的物理、化学及生物三方面因素的影响，认为各种因子的综合作用将是今后藤壶及各类污损生物附着生物学的研究方向。

1.3.2 贻贝

贻贝是污损动物中的主要优势物种，其特有的足丝可以使之牢固地黏附在各种海洋材料的表面，强大的生命力和繁殖力使之成为一种极难控制的污损动物。以贻贝为试验生物的评价方法主要是观察贻贝的附着能力和其对酚氧化酶活性的影响。

Da Gama等［31］建立了以贻贝为试验生物，以贻贝在滤纸圈的底物探索行为、配子释放、足丝附着数目为表征指标的试验方法，认为这是一个可靠、省时、低成本的表征防污材料的方法。陈志颖等［32］以翡翠贻贝为试验生物，研究了叶片山海绵共附生细菌提取物对贻贝足丝分泌物的抑制作用。冯丹青等［33］以翡翠贻贝的足部收缩试验检测了生姜不同组分的防污活性。赵红等［34］以紫贻贝为研究对象，研究了EGD杀生剂对贻贝足丝发育的抑制。Hideo等［35］以紫贻贝的足丝附着抑制试验建立了一种天然产物防污活性的生物检测模型，证明生姜中的姜酚有抑制紫贻贝足丝附着的活性。

Tsoukatou等［14］通过记录酚氧化酶的活性，采用分光光度法测定了海绵提取物对蓝贻贝的防污性。1.3.3 其他海洋动物

其他建立评价方法的海洋动物包括：卤虫、斑马鱼、牡蛎、苔藓虫等。王惠［20］选取卤虫和斑马鱼为受试生物，以96 h-LC50为毒性参数指标，对海洋防污涂料样品的急性毒性作用进行了研究。苔藓虫、牡蛎也是重要的污损生物，以二者为试验生物的评价方法，主要是通过新采集的幼虫进行的附着试验［36］。Vucko等［37］考察了苔藓虫和牡蛎幼虫在PDMS（聚二甲基硅氧烷）仿生涂层上的附着情况，研究了幼虫尺寸与织构尺寸关系对其附着的影响。

2 结语

海洋防污涂料生物评价方法的研究，一方面可以用于防污涂料的危害评估和天然无毒防污活性物质的筛选，进而推动环保型防污涂料的发展；另一方面也可用于建立防污涂料的性能测试方法，加速防污涂料的研发进程。有研究表明，很多防污活性物质对一种试验生物是有效的，而对其它一些试验生物则显示出活性很小甚至没有活性［14］，因此，建立一种能普遍适用的生物评价方法的难度可想而知。同时海洋涂料的防污性能是其全部组分相互作用的结果，即混合物毒性，产品的毒性无法用单一物质的毒性检测结果来表达［38］。

目前，海洋防污涂料的生物评价方法研究主要集中于天然无毒防污活性物质的筛选，对于防污涂料防污性能评价的混合物毒性的研究还比较少，针对防污涂料所应用的海洋环境，通过急性毒性试验的筛选，确定一种或几种有效的海洋表征生物，在现有的生物评价方法上加以完善，进而建立室内生物毒性检测方法，是推进海洋防污涂料生物评价方法用于涂料配方大通量快速筛选的技术难点和关键环节，也是今后防污涂料朝环保型方向发展的必备的技术手段。

［1］ 许凤玲，刘升发，侯保荣. 海洋生物污损研究进展［J］.海洋湖沼通报，2008（1）：146-152.

［2］ 桂泰江. 海洋防污涂料的现状及发展趋势［J］. 现代涂料与涂装，2005（5）：28-29.

［3］ Trentin I，Romairone V，Marcenaro G，et al. Quick Test Methods for Marine Antifouling P aints［J］. Progress in Organic Coatings，2001，42（1-2）：15-19.

［4］ 蔡如星，黄宗国. 海洋污损生物及其防除［M］. 北京：海洋出版社，1984.

［5］ Marhaeni B，Radjasa O K，Khoeri M M，et al. Antifouling Activity of Bacterial Symbionts of Seagrasses against Marine Biofilm-Forming Bacteria［J］. Journal of Environmental Protection，2011，2（9）：1 245-1 249.

［6］ Hellio C，Bremer G，Pons A M，et al. Inhibition of the Development of Microorganisms（Bacteria and Fungi）by Extracts of Marine Algae from Brittany，France［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2000，54（4）：543-549.

［7］ Marechal J，Culioli G，Hellio C，et al. Seasonal Variation in Antifouling Activity of Crude Extracts of theBrown Alga Bifurcaria Bifurcata（Cystoseiraceae） against Cyprids ofBalanus Amphitriteand the Marine BacteriaCobetiaMarinaandPseudoalteromonas Haloplanktis［J］. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology，2004，313（1）.

［8］ Holmstrm C，Steinberg P，Christov V，et al. Bacteria Immobilised in Gels：Improved Methodologies for Antifouling and Biocontrol Applications［J］. Biofouling，2000，15（1-3）：109.

［9］ 马红圳，谢志鹏，秦岩，等.苯并异噻唑啉酮接枝丙烯酸锌树脂的合成及抑菌性能［J］.材料开发与应用，2015（3）：12-16.

［10］ 张琦，姜晓辉，于良民，等. 多硫代丙酰胺的合成及其抑菌与海洋防污性能［J］. 精细化工，2015（2）：232-236.

［11］ 于晓琳，于良民，姜晓辉. 具类辣素结构丙烯酰胺的合成及其抑菌和防污性能［J］.应用化学，2014（5）：594-599.

［12］ 许凤玲，林强，张树芳，等. 苯并异噻唑啉酮衍生物的合成及其抑菌性能［J］. 海洋科学，2008（5）：62-66.

［13］ 沈明，徐焕志，孙保库，等. 基于海洋细菌为受试生物的海洋防污剂快速筛选方法［J］. 海洋与湖沼，2014（3）：608-616.

［14］ Tsoukatou M，Hellio C，Vagias C，et al. Chemical Defense and Antifouling Activity of Three Mediterranean Sponges of the Genus Ircinia［J］. Zeitschrift Für Naturforschung C，2002，57（1-2）：161.

［15］ Statz A，Finlay J，Dalsin J，et al. Algal Antifouling and Fouling-Release Properties of Metal Surfaces Coated with a Polymer Inspired by Marine Mussels［J］. Biofouling，2006，22（6）：391-399.

［16］ Finlay J A，Callow M E，Ista L K，et al. The Influence of Surface Wettability on t he Adhesion Strength of Settled Spores of the Green Alga Enteromorpha and the Diatom Amphora1［J］. Integrative & Comparative Biology ，2002，42（6）：1 116-1 122.

［17］ 刘红，张占平，齐育红，等.无毒防污涂料表面底栖硅藻附着评价的实验方法［J］.海洋环境科学，2006（3）：89-92.

［18］ 田斌. 海洋防污涂层生物学性能的研究［D］. 山东青岛：中国海洋大学，2005.

［19］ 王宝娟. 海洋防污涂料及其主要成分的生物学性能研究［D］. 山东青岛：中国海洋大学，2007.

［20］ 王惠. 海洋防污涂料中典型防污剂检测方法的建立及生态毒性综合评价研究［D］. 山东青岛：中国海洋大学，2014.

［21］ Iken K，Greer S P，Amsler C D，et al. A New Antifouling Bioassay Monitoring Brown Algal Spore Swim ming Behaviour in the Presence of Echinoderm Extracts［J］.Biofouling，2003，19（5）：327-334.

［22］ Dahms H U，Hellio C. 12-Laboratory Bioassays for Screening Marine Antifouling Compounds［M］//Advances in Marine Antifouling Coatings and Technologies.Woodhead Publishing，2009：275-307.

［23］ Rittschof D，Lai C H，Kok L M，et al. Pharmaceuticals as Antifoulants：Concept and Principles［J］. Biofouling，2003，19（sup1）：207-212.

［24］ Rittschof D，Clare A S，Gerhart D J，et al. Barnacle in Vitro Assays for Biologically Active Substances：Toxicity and Settlement Inhibition Assays Using Mass Cultured Balanus Amphitrite Amphitrite Darwin［J］. Biofouling，1992，6（2）：115-122.

［25］ Hellio C，Tsoukatou M，Marechal J P，et al. Inhibitory Effects of Mediterranean Sponge Extracts and Metabolites on Larval Settlement of the Barnacle Balanus Amphitrite［J］.Marine Biotechnology，2005，7（4）：297-305.

［26］ Sasikumar N，Clare A S，Gerhart D J，et al. Comparative Toxicities of Selected Com pounds to Nauplii of Balanus Amphitrite Amphitrite Darwin and Artemia sp［J］. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology，1995，54（2）：289-296.

［27］ 冯丹青，柯才焕，卢昌义，等.白脊藤壶（Balanus albicostatus）应用于天然海洋防污产物筛选模型的研究［J］. 海洋与湖沼，2008（4）：395-400.

［28］ 严涛，谢恩义，曹文浩，等.华南沿海4种主要污损生物幼虫和孢子的采集与培养技术［J］. 热带海洋学报，2011（3）：56-61.

［29］ 江学志，黄从树，黄志雄，等.草甘膦丙烯酸树脂的合成及其对微生物的抑制毒性研究［J］. 涂料工业，2012（3）：55-58.

［30］ 黄英，柯才焕，周时强.国外对藤壶幼体附着的研究进展［J］. 海洋科学，2001（3）：30-32.

［31］ Gama B A P D，Pereira R C，Soares A R，et al. Is the Mussel Test a Good Indicator of Antifouling Activity? A Comparison Between Laboratory and Field Assays［J］.Biofouling，2003，19（sup1）：161-169.

［32］ 陈志颖，王祥，苏培，等.叶片山海绵共附生细菌的防污活性研究［J］. 厦门大学学报（自然科学版），2015（3）：340-346.

［33］ 冯丹青，柯才焕，李少菁，等.生姜提取物的防污活性研究［J］. 厦门大学学报（自然科学版），2007（1）：135-140.

［34］ 赵红，严雨帆，张翀，等. 绿色杀生剂EGD控制贻贝污损的试验研究［J］. 武汉理工大学学报，2005（4）：26-29.

［35］ Etoh H，Kondoh T，Noda R，et al. Shogaols from as Promising Antifouling Agents［J］. Bioscience Biotechnology &Biochemistry，2002，66（8）：1 748-1 750.

［36］ Dahms H U，Gao Q F，Hwang J S. Optimized Maintenance and Larval Production of the Bryoz oan Bugula Neritina（Bugulidae：Gymnolaemata） in the L aboratory［J］.Aquaculture，2007，265（1-4）：169-175.

［37］ Vucko M J，Poole A J，Carl C，et al. Using Textured PDMS to Prevent Settlement and Enhance Release of Marine Fouling Organisms［J］. Biofouling，2014，30（1）：1-16.

［38］ 殷浩文，刘瑞栋.涂料的微生物毒性检测与毒性管理程序探讨［J］. 化学建材，1998（1）：22-24.

Abstract：The research progress of biological evaluation methods of marine antifouling coatings with bacteria，marine algae and marine animals as experimental organisms was introduced. The idea of further improving the

biological evaluation methods of marine antifouling coatings was put forward.

Key Words：biological evaluation；antifouling coatings；marine fouling

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