bFGF在兔口腔溃疡模型中的表达

陈琪　罗程　陈红　苏松　付文广　谢鑫　郑思琳

口腔溃疡(oral ulcer)在黏膜疾病中占据首位，不论性别、年龄、人种均可发生，是术后、肿瘤等患者的常见并发症。疼痛具有反复性、灼痛感等特征，阻碍进食、睡眠，从而导致营养不良、抵抗力下降，严重影响患者的生存质量[1-2]。目前的治疗方法有针灸、冷敷、光子照射等，治疗药物多种，但目前没有疗效明确的治疗方法与药物[3]。而基因治疗是目前尚未广泛应用又极具前景的治疗方式。所以，我们尝试从相关基因入手，碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)一种促进细胞生长的多肽生长因子，具有修复完善骨组织、血管、神经的作用，能够刺激内皮细胞增殖和新生血管的生成。那么它在溃疡组织中是如何表达呢?目前尚无明确的研究，因此，本项目拟研究在口腔溃疡兔口腔颊黏膜组织中bFGF的表达情况，尝试为口腔溃疡治疗提供新的思路。

1　材料与方法

1.1　动物

新西兰兔72 只， SPF级， 体重3 000～3 500 g，雌雄各半，购于泸州医学院实验动物中心，许可证号：SYXK(川)2013-065。

1.2　药品

口腔溃疡散(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂生产)， 3 g/瓶(国药准字Z11020184, 产品批号： 15100065)。涂于溃疡处, 2 次/d, 疗程7 d。

1.3　试剂与仪器

Rabbit anti-bFGF、 羊抗兔二抗(CST公司， 美国)； SP kit、DAB kit、First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche公司， 瑞士)； 病理切片机、紫外凝胶系统、紫外分光光度计(Bio-rad公司， 美国)。

1.4　方法

1.4.1兔口腔溃疡动物模型制备新西兰大白兔随机分为3 组，每组24 只：正常黏膜组(对照组)，不做任何处理；口腔溃疡模型黏膜组(模型组)，用直径为8 mm的玻棒蘸取浓度为40%的冰醋酸置于兔左右两侧距口角2 mm颊膜处烧灼60 s，生理盐水冲洗1 min，使局部成灰白色，直径8 mm的白色损害， 24 h后经病理检查证实兔口腔溃疡动物模型建立成功[3]。口腔溃疡模型治疗组(治疗组)，造模成功后，每天给予口腔溃疡散涂抹， 2 次/d, 疗程7 d。观察动物的精神状态、饮食状况及皮毛的变化等一般情况。在第3、 5、 7 天取各组口腔颊黏膜组织，每组各取6 只。

1.4.2实验步骤 取各组口腔颊黏膜组织： ①HE染色切片检测组织的炎症细胞、血管数目，上皮增生情况； ②RT-PCR检测口腔颊部黏膜组织中bFGF基因mRNA表达情况，Quantity One软件计算比较RT-PCR产物条带与β-actin条带的吸光度的相对比值，通过分析，最终得出相对表达量； ③石蜡切片后，用免疫组织化学法检测口腔颊黏膜bFGF的平均积吸光度值。采用计算机图像分析技术对免疫组化结果进行半定量分析。通过ImaGe-pro-plus图像系统半定量测定bFGF的表达，蛋白表达在胞浆，呈棕黄色颗粒。每张切片随机取10 个互不重叠的视野(×400)测定积分吸光度值(integral optical density, IOD)和面积累加值(Area)，IOD/Area得到平均吸光度值，结果以平均吸光度值表示。

1.4.3观察指标bFGF在兔口腔溃疡颊黏膜组织中的表达情况。

1.5　统计学处理

2　结　果

2.1　兔一般情况

造模组大鼠冰醋酸烧灼后，逐渐出现进食量下降，部分体质量与正常对照组相比明显偏低。对照组大鼠生长较好，未出现死亡病例。24 h后经病理检查证实已建立兔口腔溃疡模型(图 1)。造模成功当天，黏膜上皮破损或糜烂，大量炎细胞浸润。治疗组用药3 d后,炎细胞浸润开始减轻,坏死组织减少,边缘纤维细胞增生;用药5 d后炎症细胞明显减少,无坏死组织,大量成纤维细胞增生;用药7 d后形成癒痕组织。模型组仅在7 d后有愈合的趋向。

图 1口腔黏膜HE染色图片(×400)

Fig 1HE staining of oral mucos(×400)

2.2　RT-PCR检测结果

造模成功当天， bFGF mRNA在正常黏膜组中少量表达(0.34±0.03)，与模型组(0.60±0.06)、治疗组(0.60±0.06)比较，差异有统计学意义(P<0.05)，模型组与治疗组比较，差异没有统计学意义(P>0.05)。在用药的第3、 5、 7 天， 模型组、治疗组中bFGF mRNA的表达水平逐渐升高，治疗组高于模型组，且差异具有统计学意义(P<0.05)(图 2， 表 1)。

图 2口腔黏膜bFGF mRNA表达

Fig 2The expression of bFGF mRNA in oral mucosa

注： ①P<0.05vs对照组; ②P<0.05vs模型组， ③ 采用两因素方差分析对各组和各时间点进行分析，差异有统计学意义后，再通过Duncan检验进行两两比较

2.3　IHC结果

光学高倍(×400)物镜下: bFGF在正常口腔溃疡黏膜的上皮层和真皮层呈弱表达或不表达，阳性表达在胞质。

bFGF在正常黏膜组中少量表达0.01±0.00，模型组第1 天的表达为0.02±0.01， 2 组比较，其差异有统计学意义(P<0.05)。模型组与治疗组比较，差异没有统计学意义(P>0.05)。在用药的第3、 5、 7天， 模型组、 治疗组中bFGF的表达水平逐渐升高，模型组bFGF的蛋白表达量低于治疗组(P<0.01)，且差异具有统计学意义(P<0.05)(图 3， 表 2)。

图 3各组bFGF蛋白表达(免疫组化， ×400)

Fig 3The expression of bFGF protein in the groups(Immunohistochemistry×400)

注： ①P<0.05vs对照组; ②P<0.05vs模型组; ③ 采用两因素方差分析对各组和各时间点进行分析，差异有统计学意义后，再通过Duncan检验进行两两比较

3　讨　论

口腔溃疡(oral ulcer，OU)俗称“口疮”，是一种常见的发生于口腔黏膜的溃疡性损伤病症，多见于唇内侧、舌头、舌腹、颊黏膜、前庭沟、软腭等部位，这些部位的黏膜缺乏角质化层或角化较差。可分为轻型复发性阿弗他溃疡和慢性口腔溃疡。不论性别、年龄、人种均可发生，发病时疼痛剧烈，很难根治[4]。目前口腔溃疡的病因及发病机制尚不完全清楚，经研究认为其发病原因有多种，如环境因素、遗传因素、心理因素、病毒感染、机体免疫等[5-6]，多合并多种因素。由于口腔溃疡产生的因素较多，目前的治疗存在各种困难[7]。

就目前而言，基因治疗是一种尚未广泛应用又极具前景的治疗方案，可能对口腔溃疡的治疗产生革命性的变化，而bFGF是调控细胞生长、分化、凋亡和机体多种组织和器官形成的重要因子。在皮肤损伤、创面愈合中起着重要作用[8]。那么bFGF是否能促进口腔溃疡创面的愈合呢？因此，bFGF进入了我们的思考范围并引导设计了上述的对比试验，以期能发现一些与口腔溃疡相关的变化。

在创伤愈合过程中，血管再生是一个重要的环节，细胞生长因子对这一过程的发生和发展具有重要的调节作用。bFGF是一种促进细胞生长较强的多肽生长因子，不仅能够刺激内皮细胞增殖和新生血管的生成，还能促进胶原蛋白的合成，肉芽组织的生成，改变免疫应答[9]。Mullane 等[10]发现bFGF通过增加牙髓中的微血管密度，从而促进牙髓损伤的修复。Takamiya 等[11]研究锐器对皮肤损伤后，皮肤组织中出现bFGF蛋白表达，bFGF表达开始于损伤后0.5～1 h。 bFGF分布于体内多种细胞，以自分泌和旁分泌方式促进细胞自身与周围细胞的增殖、分化、蛋白质合成等[9]，是最有效的促血管生长因子之一[12]； 如果bFGF的数量异常、功能紊乱，则可能会出现组织、血管、神经的修复、再生障碍，创面愈合受到抑制，而bFGF的存在，可能是口腔溃疡愈合的原因之一，所以bFGF的表达是我们关注的重点。

在本试验中观察发现，通过40%的冰醋酸烧灼兔口腔颊部成功建立兔口腔溃疡模型，并且在实验中通过使用RT-PCR、免疫组织化学等方法进行检测，从而证实口腔溃疡兔的溃疡组织中bFGF出现了明显的变化，治疗组较模型组有明显的增多，随着创面的不断愈合，表达在不断升高，说明bFGF参与了口腔溃疡创面的愈合过程。由此初步考虑如果bFGF的表达增加，从而促进组织、血管、神经等的修复和再生，而溃疡形成当天，bFGF的表达最低，机体处于损伤状态； 如果bFGF的表达持续低下，溃疡创面则得不到恢复。目前所用治疗口腔溃疡的药物存在种类繁多、治疗效果不佳、副作用大等缺点，尚无通过基因治疗口腔溃疡的药物。因此，bFGF基因表达变化的发现，可能为基础研究和临床治疗口腔溃疡提供新的药物治疗靶点[13]，找到一种新的治疗手段和方向。

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