几种常用的氨基酸分析技术研究进展

马 璐,雷 禄,黄雪秋,凌绍明

(1.百色学院 预科教育学院，广西 百色 533000； 2.百色学院 化学与环境工程学院，广西 百色 533000)

氨基酸是重要的生命物质，分子结构中既含有羧基又含有氨基，是蛋白质的基本组成单元，也是肌酸、肽类激素、神经递质等含氮类物质的原料来源。氨基酸在自然界中的存在形式既有游离态又有结合态。氨基酸分析在生物、医学、食品等领域都有重要的意义。本文对目前用于氨基酸分析的几种常用方法进行综述。

1 高效液相色谱法

高效液相色谱法(HPLC)灵敏度高、分析快、适用性强，在定性定量检测得到广泛的应用。氨基酸分析方法主要采用反相HPLC，反相HPLC常以C18键合硅胶为固定相。由于大多数氨基酸缺乏具有强紫外吸收或有荧光效应的官能团，需要借助衍生试剂将氨基酸转化成能被灵敏检测的衍生物。目前氨基酸检测多以柱前衍生反相高效液相色谱法为主。

孙言春等[1]以6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)为柱前衍生试剂，采用BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)分离柱，以乙腈 ( 含0.15% (v/v ) 甲酸及30 mmol/L 乙酸铵) 和30 mmol/L乙酸铵水溶液为流动相，流速为0.7 mL/min，光电二极管阵列检测史氏鲟 、达氏鳇和小体鲟卵中17种氨基酸的含量。熊少祥等[2]采用3-对羧基苯甲酰喹啉-2-甲醛(CBQCA)将一级氨基酸衍生为具有强荧光信号的7-氮杂-1-氰基苯并异吲哚，建立了分离检测鼠脑微透析液中氨基酸的反相HPLC新方法，该研究采用自组装的高效液相色谱-激光诱导荧光-增强型电荷耦合器件检测器装置，比常规的荧光检测器具有更优异的性能。白文莉等[3]采用反相HPLC梯度洗脱分离，异硫氰酸苯酯(PITC)为柱前衍生剂，以正缬氨酸为内标，紫外检测器测定马破伤风免疫球蛋白F (ab＇)2中甘氨酸的含量。

近年来，液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术发展迅速，质谱能提取和确证特征性离子，具有较高的选择性和灵敏度，且一般无需对样品进行衍生化处理，简便、快捷，该技术在氨基酸分析中有重要的应用。

Dietzen等[4]建立了LC-MS/MS法检测血浆、血清和尿液中的氨基酸，30种氨基酸在20 min内达到基线分离，并将该方法与阳离子交换法进行对比，结果表明该方法耗时更少，选择性更佳。邓其馨等[5]建立LC-MS/MS法对烟草中的游离氨基酸进行定量分析，18种氨基酸在20 min内得到很好的分离和测定，线性相关系数均大于0.9990，检出限为0.5×10-4～0.1 mol/L，加标平均回收率为90.0%～106.0%。该方法简单、重现性好，灵敏度高，满足分析要求，适合烟草中游离氨基酸的检测。郑重等[6]用甲醇为样品的提取试剂，无需衍生步骤，利用LC-MS/MS直接检测敖东植物酵素中16种氨基酸的含量。线性相关系数均大于0.99，样品回收率为86%～110%。郭华等[7]以邻苯二甲醛衍生珍珠粉酸解液，采用LC-MS/MS技术同时分析珍珠粉中的7种氨基酸，7种氨基酸在0.1～100 μg/mL范围内呈现良好的线性关系，相关系数在0.9928～0.9990范围内，检出限在0.03～15 ng/mL之间，回收率为95%～105%。

随着分析技术的不断提高，在HPLC的基础上又开发出了检测性能更优异的分析仪器-超高效液相色谱(UPLC)，UPLC比普通HPLC具有更好的分离度和更高的灵敏度，极大地缩短了分析的时间，使得UPLC-MS/MS方法在氨基酸分析领域表现出更为广阔的应用前景。

Armenta等[8]建立了一种快速、重现性好、灵敏的UPLC-MS/MS法分析了恶性疟原虫和人体红细胞中氨基酸的含量。Helmond等[9]使用酰胺型固定相，建立UPLC-MS/MS法用于检测指纹样品中的氨基酸，样品无需衍生，可直接检测。黄鑫等[10]建立了检测大鼠海马和大脑皮层中生物胺类及氨基酸类神经物质的UPLC-三重四极杆质谱法，不需要对样品进行衍生化和固相萃取等复杂处理，10 min内即可完成样品中17 种神经化学物质的分离及确证，该方法检测时间短、灵敏度高、专属性强、稳定性良好。李好丽等[11]为了分析烤烟中氨基酸含量与烤烟香型、产地的关系，以AQC为柱前衍生试剂，建立了UPLC-单重四极杆质谱法同时测定烤烟中20种游离氨基酸的分析方法。王星等[12]采用PITC为衍生化试剂，建立了一种快速、灵敏、准确的UPLC-MS/MS方法解析中药材天南星中20个成分，其中包括2个胺类化合物和18个氨基酸，为中药材中氨基酸类极性非紫外活性成分的分析方法的建立提供依据。

2 气相色谱

气相色谱是在氨基酸分析领域有较早应用历史的分析技术，由于氨基酸沸点较高，在测定前需将氨基酸衍生化为易汽化的衍生物。气相色谱具有快速、简便、灵敏、易于与质谱联用等优点，不足之处在于衍生化过程易产生干扰物。

Persson等[13]将氨基酸进行叔丁基二甲基硅烷化，并用13C、15N标记方法，采用气相色谱串联质谱(GC-MS/MS)对植物中的氨基酸进行定量分析。张红漫等[14]先用盐酸水解沙苑子样品，再对其水解液进行酯化和酰化处理，采用GC-MS/MS共鉴定出15种氨基酸，其中7种为人体必需氨基酸，再由外标法对每种氨基酸进行了定量分析，结果表明沙苑子中氨基酸的总质量分数为4.32 %。侯捷等[15]建立了固相萃取-硅烷化衍生-气相色谱质谱法联用分析精氨酸发酵液中的15种氨基酸，并计算15N标记精氨酸发酵液中的氨基酸同位素丰度。杨芹等[16]用甲基叔丁基醚-甲醇-水体系提取蝎子样品后，对提取液上层有机相物质进行甲酯化处理，对下层水相进行硅烷化处理，再经气相-质谱联用分析，研究发现在有机相中检测到 30 种脂肪酸，在水相中检测到氨基酸类、糖类及有机酸类等化合物，其中检测到的氨基酸有18种。黄志等[17]以N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺为衍生化试剂，对萃取过的烟叶样品进行硅烷化衍生，再利用GC-MS/MS测定烟草中18种游离氨基酸，结果表明18种氨基酸的加标回收率为97.4%～114.1%，RSD在0.17%～3.4%范围内，该方法快速、灵敏、准确，可用于烟草中氨基酸含量分析。

3 毛细管电泳

毛细管电泳(CE)是以高压直流电场为推动力，毛细管为分离通道建立起来的分离技术,不仅具有样品用量少、分离效率高、分析速度快、成本较低等优点，且还能分离手性氨基酸。氨基酸样品经毛细管电泳仪分离后，能被相应的检测器识别，实现氨基酸的定性和定量分析。

Qi等[18]建立了手性配体电泳法对丹酰基氨基酸进行手性分离和检测，该方法成功分离了17对氨基酸对映体，还能用于测定米醋中氨基酸的含量。Lorenzo等[19]建立了一种以4-氟-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑为衍生试剂的毛细管电泳-激光诱导荧光法成功测定了16份不同尿液样品中7种氨基酸的含量。胡月芳等[20]建立了毛细管电泳-电化学检测(CE-ED)法测定淮山中8种必需氨基酸含量。先用乙醇处理淮山样品，再用邻苯二甲醛对样品进行衍生处理，采用CE-ED测定，8种氨基酸在12 min内达到了基线分离，检出限为0.01～0.05 μg/L。周贤婧等[21]基于样品注入后背景吸收添加剂吸光度的减小，建立了毛细管电泳-间接紫外检测法用于检测蜂蜜中 9 种游离氨基酸，蜂蜜无需衍生，经阳离子交换树脂除去糖类物质后直接进样分析，9 种氨基酸于11 min 内实现了分离，检出限最低达到0.3 mg /L，该方法已成功应用于不同蜜源植物和产地的蜂蜜的测定。任挺钧等[22]建立了毛细管电泳-电容耦合非接触电导检测法同时分析运动员营养补剂中的支链氨基酸(亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)，3种氨基酸在以乙酸为背景电解质下，在20 min内得到了基线分离，该方法避免了样品衍生化处理，操作简便、灵敏度较高。

4 离子交换色谱

阳离子交换色谱法是基于氨基酸在酸性条件下变成阳离子并经阳离子交换色谱柱分离后，再与茚三酮发生衍生化反应，产生能被紫外-可见光检测器检测的紫色或深蓝色或黄色衍生物。以此为原理，科学家研发出了能使氨基酸分析实现自动化的氨基酸分析仪，氨基酸分析仪极大缩短分析的时间。该方法具有分析快速、重现性好、自动化程度高、准确度高、能检测多数氨基酸等优点，但存在仪器造价高、灵敏度不高且需双波长检测等不足。

冯志强等[23]建立采用全自动氨基酸分析仪测定酱油中氨基酸的含量的方法，结果表明酿造酱油和配制酱油中氨基酸的种类及含量存在一定的差异，分析结果为酿造酱油和配制酱油的鉴别提供了一定的依据。苗雨田等[24]将黄酒经氮气吹干复溶后、过膜,采用全自动氨基酸分析仪对黄酒中的游离氨基酸进行测定，方法检出限最低可达到0.01 mg/100 mL,回收率为90.1%～101.2%,该方法具有可靠、快速、重现性好等优点，适用于大量样品的分析。黄永连等[25]利用盐酸水解藻类后，采用氨基酸自动分析仪分析不同藻类样品中氨基酸的组成及含量。

阴离子交换色谱-积分脉冲安培(HPIC-IPAD)法是一种最近发展起来的氨基酸检测方法，具有快速、准确、灵敏、选择性高等特点，且无需对样品进行柱前或柱后衍生处理，能对氨基酸进行直接分析。

李国强等[26]建立分析人血浆中16种游离氨基酸的HPIC-IPAD法，检出限为0.11～3.3 μg/L,样品回收率为 87%～117%，该方法操作简单，样品无需衍生。Rombouts等[27]建立了简便、准确的HPIC-IPAD测定小麦蛋白、麦胶蛋白、麦谷蛋白中的氨基酸，样品经盐酸水解后直接分析，无需衍生化或氧化处理。吴伶俐等[28]以AminoPac PAl0 为氨基酸分析柱，水、250 mmol/L NaOH和1 mol/L NaAc 为流动相，采用HPIC-IPAD法对榴莲中的17种氨基酸进行定性和定量分析，方法检出限为0.0028～0.0136 μmol/L，样品加标回收率在80.0%～112.9%之间，为榴莲的食用和药用价值的深入研究提供了参考。于宏晓等[29]采用AminoPac PA10阴离子交换柱，用HPIC-IPAD法测定烟草中18种氨基酸的含量，最低检出限为0.03～0.75 μg/mL，利用该方法还对比了3种不同类型单料烟和国内外不同卷烟中游离氨基酸的含量。

5 小结

氨基酸分析已成为食品、生命、医药等众多领域的重要内容，其分析方法的研究与改进也受到越来越多的关注。在衍生方法、柱载体化学和自动化技术发展的驱动下，涌现出一系列氨基酸分析技术，但这些分析方法各有其优缺点。HPLC是氨基酸分析常用的方法，但易受衍生技术的限制。HPLC与能提取特征性离子的MS联用，一般无需衍生处理可直接检测氨基酸，在氨基酸检测领域有重要应用。UPLC-MS/MS不仅分析效率比常规HPLC高，且还能对氨基酸样品进行直接测定。GC虽与MS联用，但该技术会受到衍生副产物的干扰。氨基酸分析仪自动化程度高，但仪器多为国外进口品牌，在成本上受到一定的限制。CE技术在手性氨基酸分析中有重要应用。HPIC-IPAD能直接检测氨基酸，避免样品衍生步骤，有望成为氨基酸分析方法改进和完善的新方向。经过不断改进和完善，前处理简单、分析速度更快、选择性好、准确度高的氨基酸分析技术将会不断涌现，为氨基酸分析领域打开新局面。