实时定量PCR检测流感嗜血杆菌感染实验室诊断方法的建立

蔚 然，王良玉，高 琦，胡文娟，窦海伟，向 莉，辛德莉，郭东星△

(1．首都医科大学附属北京友谊医院/北京热带医学研究所,北京100050 ；2.首都医科大学附属北京儿童医院，北京100050)

流感嗜血杆菌(Hi)为革兰阴性菌，是人类呼吸道黏膜的常见定植细菌。流行病学调查显示北京地区5岁以下急性呼吸道感染患儿2000-2002年呼吸道Hi携带率为26.1%，随着疫苗的应用Hi携带率有所下降，但2010-2012年仍高达16.3%[1]。Hi是儿童时期细菌性脑膜炎、肺炎和菌血症的重要病原菌之一，还可导致儿童中耳炎、上颌窦炎、急性会厌炎、化脓性关节炎和眼内炎等[2]，给儿童健康造成很大威胁。由于Hi毒力较强，病情变化快，其导致的小儿肺炎属于较严重的一种类型，病死率没有得到有效控制，各地的诊治方法也无标准，常有漏诊、误诊情况[3]。Hi的早期、快速、准确检测，对疾病的早期治疗、疾病的转归及预后起到非常重要的作用。现有诊断方法，如分离培养、血清学诊断等不能满足临床需要，需不断探索早期、快速诊断Hi感染的新方法。近年来，分子生物学诊断正逐渐成为研究的热点。本研究拟建立一种SYBR-Green染料法实时定量聚合酶链反应(PCR)检测Hi感染的方法，以期实现Hi的临床早期、快速、准确诊断。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 采集2014年9-12月就诊于北京儿童医院的患儿咽拭子标本226份。本研究通过伦理审查，患儿家属均知情同意。菌株：肺炎支原体标准株M129菌株(ATCC29342)、人型支原体标准株(ATCC15488)、阴沟肠杆菌标准株(ATCC700323)、金黄色葡萄球菌标准株(ATCC25922)、肺炎克雷伯菌标准株(ATCC1705)和大肠埃希菌标准株(ATCC25922)，含有Hi fucK基因质粒的大肠埃希菌冻存于本研究室。

1.2仪器与试剂 ABI公司Prism@7500型荧光定量PCR仪；高纯度质粒小提试剂盒(康为世纪生物科技有限公司，货号CW0500S，生产批号20121)；通用型柱式基因组提取试剂盒(康为世纪生物科技有限公司，货号CW2298S，生产批号40137)；PCR荧光染料为ULtra SYBR Mixture(康为世纪生物科技有限公司，货号CW2601M，生产批号10209)。

1.3方法

1.3.1构建标准品 复苏冻存于-80 ℃冰箱的含有Hi fucK基因的大肠埃希菌，构建质粒，采用康为世纪高纯度质粒小提试剂盒提取质粒，实验操作参考产品说明书。对提取的质粒进行定量分析，10倍稀释构建水平为108、107、106、105、104、103、102、10 copy/μL的质粒作为标准品，保存于-80 ℃备用。

1.3.2设计并合成引物 针对Hi的fucK基因设计引物Hi-F/Hi-R，引物序列Hi-F：ATGGCGGGAACATCAATGA；Hi-R：ACGCATAGGAGGGAAATGGTT。引物由美国Invitrogen公司合成，经HPLC方式纯化。

1.3.3绘制标准曲线 以标准品为模板进行染料法荧光定量PCR，绘制标准曲线。荧光定量PCR反应体系：2×Taqman缓冲液10 μL，引物Hi-F/Hi-R各0.3 μL， DNA 模板2.0 μL，ddH2O 8.0 μL，总体积20.0 μL。反应条件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。采用ABI公司7500型荧光定量PCR仪的SDS软件分析实验结果并绘制标准曲线。

1.3.4方法学验证 (1)敏感度：将构建的标准品稀释为107、106、105、104、103、102、10 copy/μL，采用和绘制标准曲线时相同的反应体系和反应条件，检测新建的实时荧光定量PCR的敏感度。(2)特异度：以本实验室保存的肺炎支原体、人型支原体、阴沟肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的DNA作为检测模板，验证新建的实时荧光定量PCR特异度。(3)检验临床标本：采集的226份儿科患儿的咽拭子标本，均采用通用型柱式基因组提取试剂盒提取DNA，实验操作参考产品说明书。用新建的实时荧光定量PCR检测Hi的感染情况，反应体系和条件均参照构建标准曲线时采用的体系和条件。根据标本扩增的Ct值≤38、Tm值与标准品相符，且结合扩增曲线、溶解曲线，判定为阴阳性。

2 结 果

2.1标准曲线 10倍梯度稀释用标准株提取的质粒，108、107、106、105、104、103、102、10 copy/μL的质粒标准品，用Hi-F/Hi-R引物分别扩增标准品，以标准品水平为横坐标，对应的Ct值为纵坐标，采用SDS软件分析实验结果并绘制标准曲线。标准曲线方程：Y=-3.335 976X+35.492 149(R2=0.999)；模板量与Ct值具有良好的相关性，能够对模板定量。见图1。

图1 标准曲线

2.2敏感度 10倍梯度稀释用标准株提取的质粒，108、107、106、105、104、103、102、10 copy/μL的质粒标准品，用Hi-F/Hi-R引物分别扩增标准品，检验新建荧光定量PCR的敏感度。新建实时荧光定量PCR可检测拷贝数为10 copy的基因模板。见图2。

注：108、107、106、105、104、103、102、10分别代表标准品模板拷贝量

图2标准品扩增曲线

2.3特异度 大肠埃希菌、阴沟肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体、肺炎克雷伯菌和人型支原体标准株的DNA作为检测模板，验证新建实验室诊断方法的特异度。结果显示以上几种病原体DNA均为阴性，新建实验室诊断方法具有良好的特异度。见图3。

注：A为Hi标准品；B为阴沟肠杆菌标准株；C为大肠埃希菌标准株；D为肺炎支原体标准品；E为金黄色葡萄球菌标准品；F为人型支原体标准品；G为肺炎克雷伯菌标准株

图3 Hi的标准品与其他菌株标准株的溶解曲线

2.4临床标本检测 用新建实时荧光定量PCR检测临床标本提取的DNA，结果显示，226份咽拭子标本Ct值≤38，Tm值与标准品相符；结合扩增曲线、溶解曲线，判定为阳性，阳性检出率为40.70%。PCR阳性产物测序(由生工生物工程股份有限公司完成)并与美国国立生物技术信息中心(NCBI)已发布的Hi菌株的基因序列比对，阳性率为92.3%。见图4。

注：A为溶解曲线；B为扩增曲线

图4临床标本、Hi标准品的溶解曲线与扩增曲线

3 讨 论

有研究报道，综合192个国家的流行病学调查显示，肺炎仍是导致儿童死亡的首要病因，其中由Hi引起的死亡占16.0%，我国由Hi感染引起的死亡占21.2%，高于世界平均水平[4-5]。可能由于Hi感染的临床表现及胸部X线征象缺乏特异性，诊断Hi感染往往需要结合实验室诊断方法[6]。对Hi感染的早期、快速、准确诊断对指导临床合理规范用药至关重要。

传统的分离培养被认为是诊断Hi感染的金标准，但培养所需时间较长(36～72 h)，难以实现快速鉴定[7]，对临床早期诊断的意义不大。该方法受培养条件、标本保存与运输、实验室培养条件等诸多因素影响。有报道称，经改良培养基后，Hi分离率有所提高，也仅为59.9%[8-9]。血清学诊断方法主要通过检测血清中的特异性抗原、抗体滴度的变化等判断病原体感染，有研究报道其敏感度高于分离培养[10]。但血清抗体产生需4～5 d,不能进行快速检测，且容易产生假阴性。因此，血清学诊断方法常用于回顾性诊断，不建议作为确诊依据[11-12]。

分子生物学诊断技术自1990年首次用于Hi的鉴定后，因其快速、敏感、特异、简单等优点，受到国内外学者的广泛关注。目前已报道的分子生物学诊断Hi感染的方法有传统PCR、巢式PCR、多重PCR、高分辨率溶解曲线等[13]。NAKHJAVANI等[14]将PCR用于Hi的检测，并与常规培养法和血清学方法比较,PCR使检出率明显提高。理论上认为实时定量PCR较传统PCR更敏感，并可实时监测，实验过程中即可判断结果。实时定量PCR较巢式PCR，可以减少核酸污染问题，操作更简便。实时定量PCR相较于多重PCR，用时更短，实验条件更易优化，敏感度更高。有研究显示，以实时定量PCR为参考标准，多重PCR的敏感度、特异度分别仅为30.0%、75.0%[15]。

COUGHLAN等[16]研究证实，fucK基因是目前发现的Hi特异度、敏感度最高，应用最广的基因。本研究针对Hi的fucK基因设计引物，保障引物设计的合理性、可行性。相对于探针法，染料法不需要设计特异性探针，成本更低，更简单。荧光定量PCR相对于常规分离培养和血清学诊断更加快速、简易。本方法可检测Hi基因拷贝数为10 copy的样品，相较于商品试剂盒[17]，其具有较高的敏感度，且成本较低。采用几种不同常见细菌DNA标本，验证其特异度，本实验中几种病原不存在交叉反应，具有良好的特异度。但所选用的特异性实验菌种较为有限，在后续研究中，还应选择更多的菌种进行实验，对其特异度进一步的验证。完善和优化实验条件后，226份临床标本检出Hi阳性92份，阳性率为40.70%。其PCR阳性产物测序与NCBI已发布的HI菌株的基因序列比对，准确率为92.3%。

综上所述，本研究中建立的实时定量PCR检测Hi的实验室诊断方法具有早期、快速、简便、灵敏的优势，是Hi感染临床诊断、流行病学调查、混合感染判定的可行手段，具有较高的推广应用价值。

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