低氧对人结肠癌细胞自噬相关分子表达的影响

刘雅婷，李 鑫，王 娜，宋飞雪

(兰州大学第二医院 肿瘤内科， 甘肃 兰州 730000)

在肿瘤发展的早期，氧气是限制肿瘤生长的因素，其主要原因在于早期肿瘤细胞快速增殖，导致肿瘤内部氧气的供应小于消耗，造成低氧，此时细胞还未激活肿瘤细胞抗低氧基因和相关信号通路，例如HIF- α、糖酵解和侵袭转移相关基因[1]。当肿瘤发展至后期时，低氧微环境可以促进肿瘤的生长，目前研究发现促进作用可以通过多种途径实现，低氧可以诱导HIF- α表达升高，激活肿瘤细胞发生自噬，通过“吃自己”抵抗低氧引起的营养供应不足[2]，激活血管生成，转变肿瘤细胞的供能方式，由氧化磷酸化为主向糖酵解为主转变[3]，提高肿瘤细胞的侵袭能力[4]。在前期研究中发现低氧可通过启动凋亡抑制SW480细胞发生转移，通过启动自噬保护CD133+免于凋亡[5]，其具体的分子机制并未被阐释，本实验将对低氧引起的这种在不同细胞类型上的自噬差异进行初步的探索，为临床治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：人结肠癌细胞系SW480(中国科学院上海生物研究所)；CD133+细胞(磁珠分选SW480细胞中CD133表达阳性亚群)；人结肠癌组织：收集甘肃省人民医院病理科2008年6月至2009年9月手术切除的94例结直肠癌标本。其中男性56例，女性38例，年龄27～ 80岁，中位年龄56岁。按照2000年版世界卫生组织消化系统肿瘤分类标准对以上标本进行组织学分型和病理分级，其中，1)按Duke’s分期：A期2例；B期53例；C期34例；D期5例。2)按组织学类型：Ⅰ级，高分化管状和乳头状腺癌1例；Ⅱ级，中分化腺癌67例；Ⅲ级，低分化腺癌和印戒细胞癌26例。3)按部位：结肠癌16例，直肠癌78例。4)按有无淋巴结转移：有转移42例，无转移52例。

1.1.2 主要试剂:细胞培养基DMEM/F12(PeproTech公司)；新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；CD133磁性微珠(Miltenyi公司)；B27(Sigma公司)；bFGF(PeproTech公司)；EGF(Gibco公司)；抗HIF- 2α抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；SP9001免疫组化试剂盒(中杉金桥公司)，Western blot所有抗体(Solarbio公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫磁珠分选SW480细胞：取10瓶常规培养的处于对数增殖期SW480 细胞(细胞数为107个)，按免疫磁珠分选说明书进行分选，将分选后得到的CD133+细胞与未分选的SW480行常规培养和低氧(1% O2)培养，其中CD133+细胞培养于含 2% B27、 20 μg/L bFGF、20μg/L EGF的 DMEM/F12培养基中，每3 d加液1次，分别于分选后 0、7和14 d倒置显微镜观察细胞增殖情况。

1.2.2 免疫荧光检测HIF- 2α表达：取对数增殖期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液。将细胞接种到预先处理好的6孔板中的盖玻片上，孵箱培养1 d，待细胞贴壁后分别在正常氧含量及低氧含量的微环境中培养48 h，取出盖玻片，浸入PBS洗2次，每次5 min，95%乙醇固定10 min；PBS洗3次，每次5 min，0.2% Triton- 100透化30 min；PBS洗涤3次，每次5 min，5% BSA室温封闭30 min；加入一抗放在湿盒里4℃过夜，取出37 ℃孵育45 min；PBS洗涤3次，每次5 min，加入二抗30 min避光；PBS洗涤3次，每次5 min，加入DAPI避光30 min；PBS洗涤3次，每次5 min，95%甘油封片，荧光显微镜下观察，阳性细胞将在胞质及胞膜处出现绿色荧光。

1.2.3 Western blot检测自噬相关蛋白LC3的表达：取预处理的SW480及CD133+细胞，消化后，收集于2 mL离心管中，PBS低温离心洗涤后，置于冰上，每组加入200 μL细胞裂解液，再加入10 μL/mL 的PMSF，吹打均匀，超声波破碎，每组细胞重复10次，然后涡旋振荡15 s，冰上放置10 min，重复3次。恒温离心机温度控制于4 ℃、15 000 r/min离心30 min，收集上清，得到蛋白裂解液，最后进行分装，每管50 μL，-80 ℃冰箱保存备用。利用Bradford法测定各组蛋白含量后，取出已经分装好的蛋白，加入5×上样缓冲液，沸水中煮10 min，冷却后加入预先制好的SDS-PAGE凝胶中，进行电泳，待其电泳完成后，将分离的蛋白样品转移到PVDF膜上，封闭后，进行免疫印迹杂交，其中GAPDH抗体1∶1 000稀释，LC3抗体1∶1 500稀释。显影之后的胶片利用计算机进行扫描，再利用IPWIin51软件分析，对每个条带进行定量，最终将图像的观察转为定量的结果。

1.2.4 免疫组化染色检测HIF- 2α和Beclin的表达：组织切片60 ℃恒温箱中烤片过夜，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，温水漂洗，蒸馏水浸泡，柠檬酸钠修复，自然冷却，蒸馏水冲洗，然后按免疫组化试剂盒说明操作。结果判定：HIF- 2α和Beclin组织切片显示以胞质染色为淡黄色至棕褐色颗粒者为阳性。于光学显微镜下随机选取3个有代表性的不同视野，每个视野的得分由阳性染色细胞所占面积和细胞染色强度两者计分之和来判断。染色面积计分为：阳性染色细胞<5%计0分；5%～25%计1分；26%～50%计2分；>50%计3分。细胞染色强度：不染色计0分；淡黄色计1分；棕黄色计2分；棕褐色计3分。若两种计分之和≤2，则为阴性表达，>2则为阳性表达。(-)为阴性，(+)为弱阳性表达，(++)～(+++)为强阳性表达。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 低氧微环境对SW480细胞系HIF- 2α表达的影响

较对照组，低氧环境可诱导SW480细胞中HIF- 2α的表达上升，并且随着低氧处理时间的增长，HIF- 2α的表达量不断增加(图1)。

2.2 低氧对结肠癌细胞自噬相关蛋白LC3的影响

低氧诱导SW480和CD133+细胞中LC3Ⅰ表达增加。但随着低氧时间增长，SW480细胞中LC3Ⅱ表达逐渐减少，CD133+细胞中LC3Ⅱ表达逐渐增加 (图2,3)。

2.3 HIF- 2α及Beclin1在结直肠组织中的表达

2.3.1 HIF- 2α在结直肠组织中的表达：在结直肠癌组织中例中，高中分化组HIF- 2α在肿瘤细胞中阳性表达率为60.3%，低分化组HIF- 2α在肿瘤细胞中阳性表达率为84.6%，低分化组HIF- 2α的表达率大于高分化组(P<0.05)；淋巴结转移组中HIF- 2α的表达率为52.4%，显著低于淋巴结无转移组中78.8%(P<0.05)。HIF- 2α的表达与结直肠癌患者的性别、年龄、浸润深度、Duke、S分期以及生长部位无明显相关性(图4)。

A .immuhistochemistry;B.statistical analynasis results of A；*P<0.01 compared with control group；△P<0.01 compared with hypoxia 24 hours goup

图2 低氧对结肠癌细胞自噬相关蛋白的影响Fig 2 Effects of hypoxia on colon cancer cell autophagy-related protein

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with hypoxia 24h group图3 低氧对结肠癌细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ的影响Fig 3 Effects of hypoxia on colon cancer cell autophagy-related protein LC3Ⅱ

2.3.2 Beclin1在结直肠癌组织中的表达：在结直肠癌组织中(94例)中，高中分化组Beclin1的表达率为63.2%，显著低于低分化组的84.6%(P<0.05)；淋巴结有转移组中Beclin1的表达率为78.6%高于无转移组中的57.7% (P<0.05)。Duke、s分期的A-B期中Beclin1的表达率为56.4%低于C-D期的82.1%(P<0.01)。Beclin1的表达与结直肠癌患者的性别、年龄、浸润深度及生长部位无明显相关性(图4)。

3 讨论

低氧作为肿瘤微环境的一个主要特点，在肿瘤发展的不同时期起着不同的作用[4]。HIF- α在低氧环境中最先被诱导表达，激活下游多种细胞抗低氧相关基因的表达。在结直肠癌细胞系SW480中，CD133+细胞是一类具有干细胞特性的癌细胞。低氧可以维持CD133+细胞的表型、抑制其向成熟的肿瘤细胞分化[6]。自噬在生物发育、维持内稳态、衰老等方面起重要作用[7]，但在某些肿瘤细胞中发现自噬可保护细胞免受凋亡[8]。研究显示在SW480细胞系中，低氧可诱导大部分SW480细胞死亡，却能促进CD133+细胞发生自噬规避凋亡[5]。

本实验中，免疫荧光结果显示，与常氧环境中相比，低氧环境可诱导SW480 细胞中HIF- 2α表达上升并在细胞膜周围不断聚集。研究显示HIF- 2α可激活BNIP3和NIX的转录，进而抑制Beclin3和Bcl- 2的功能，抑制细胞凋亡。细胞内NIX表达WXXL基序，该基序可被LC3识别并结合[9]，导致产生自噬。Western blot结果显示低氧诱导SW480和CD133+细胞中LC3Ⅰ表达增加。但随着低氧时间增长，SW480细胞中LC3Ⅱ表达逐渐减少，CD133+细胞中LC3Ⅱ表达逐渐增加，表明导致在低氧环境中CD133+细胞存活能力强的原因在于自噬的增强。

图4 Beclin1和HIF- 2α在结肠癌组织中的阳性表达Fig 4 Positive expression of Becline1 and HIF- 2α in colorectal carcinoma

本实验选取HIF- 2α及Beclin1，观察二者在结肠癌组织中的表达。在结肠癌组织学实验中，HIF- 2α的表达率在低分化组中高于高分化组，在淋巴结无转移组中高于淋巴结有转移组。Beclin1表达率在低分化组高于高分化组，淋巴结转移组高于无淋巴结转移组。Duke、S分期中，Beclin1阳性表达率C-D期高于A-B期(P<0.05)。而HIF- 2α和Beclin1的表达与结直肠癌患者的性别、年龄、浸润深度及生长部位不相关。HIF- 2α在低氧时会聚集，虽然之前有报道提示HIF- 2α的表达在肿瘤组织中会受限[10]，但在本实验中高表达。随着结肠癌组织分化程度的降低恶性度越高，组织发生缺氧程度越高，自噬水平越高；低氧微环境及自噬在结肠癌发生中可能具有促进作用。

综上可知低氧可引起SW480细胞HIF的升高，促进LC3的表达，从而启动大部分SW480细胞自噬性凋亡，但对于SW480细胞中一小部分CD133+细胞，由低氧引起的自噬并不能使其发生凋亡，而是通过自噬将细胞器降解，为癌细胞存活提供营养物质。

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