bFGF促进大鼠血脊髓屏障的修复

张 谢，周 华，张宏宇，肖 健*

(1.宁波市医疗中心李惠利医院 药剂科， 浙江 宁波 315040； 2.温州医科大学 药学系， 浙江 温州 325035)

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是严重危害人类生存和生活质量的一类中枢性神经创伤。血脊髓屏障(blood spinal cord barrier, BSCB)的破坏将严重扰乱脊髓内环境稳态，是脊髓损伤后难愈的重要原因，是后续其他损伤机制相互联系、互相作用的重要通路和中心环节[1]。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)，是一个具有神经保护作用的细胞因子[2- 3]。本研究旨在研究bFGF对体内BSCB的维护是否具有保护作用，并探讨其相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

药品与试剂 bFGF(中国格鲁斯特公司),p120-catenin、β-catenin、claudin- 5和occludin抗体(Abcam 公司)，羊抗兔 IgG-HRP(Bioworld公司),其他所有试剂(Sigma公司)。

SPF 级，SD大鼠，体质量为220～250 g [上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号：SCXK(沪)2012- 0002]。在温州医科大学动物实验中心分笼饲养。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理：将动物随机分为3组，假手术组(sham)，模型组(SCI)腹腔内注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉，暴露脊柱 T8-10段，固定于打击器平台，撞击T9节段，打击器力度约150 kdyn，bFGF干预组(SCI+bFGF)术后30 min，背部给予bFGF(80 μg/kg)，之后每隔1 d给药1次，每组各6只，于术后14 d处死。

1.2.2 BBB评分观察大鼠后肢运动功能：根据BBB评分标准[4]，在脊髓损伤后1、3、7和14 d进行评分。评分采用双人双盲法，独立观察各组大鼠双后肢行动能力并记录。

1.2.3 动物组织处理及组织切片：腹腔注射10% 水合氯醛麻醉，先用0.9%氯化钠溶液快速冲洗，再用4%多聚甲醛灌注固定。剥取损伤脊髓T7-T10，然后将其置于15% 蔗糖溶液中4 ℃过夜，OCT包埋，液氮凝固，存于-80 ℃备用。组织切片：将包埋好的组织块在-20 ℃ 冰冻切片机内复温30 min，进行切片，厚度均为20 μm(用于伊文思蓝直接观察)或5 μm(用于HE染色，免疫荧光染色)，存于-20 ℃备用。

1.2.4 HE染色观察组织：冰冻切片室温复温30 min，85%乙醇45 s，95%乙醇1 min，100% 乙醇Ⅰ 12 min，100%乙醇Ⅱ 2 min梯度脱水，苏木精-伊红染色，中性树胶封片，镜下观察。

1.2.5 伊文思蓝检测通透性：经尾静脉注射2%伊文思蓝溶液(4 mL/kg)，2 h后，用0.9%氯化钠冲洗至全身血液冲净。取脊髓组织T7-T10段，按脊髓组织重量(g)与甲酰胺体积(mL)1∶5比例萃取。37 ℃水浴锅孵育3 d，15 000 r/min离心30 min，取上清，检测其荧光强度。

1.2.6 FITC-dextran检测通透性：经尾静脉注射 FITC-dextran溶液(4 mL/kg)，2 h后，用0.9%氯化钠溶液冲洗至全身血液冲净。取1 g脊髓组织，加10 mL0.9%氯化钠溶液，12 000 r/min离心10 min，取上清。甲醇与乙醇按1∶2的比例混合，取200 μL加入到收集的上清中，测定析出，3 h后，12 000 r/min离心20 min，吸取上清液200 μL，酶标仪检测其荧光强度。

1.2.7 Western blot 法检测蛋白表达：上样量100 μg，用10.6% 凝胶恒压分离，湿转到PVDF 膜上，5%脱脂牛奶室温封闭。膜用1×TBST洗涤3，一抗浓度为1∶1 000, 4 ℃孵育过夜，二抗浓度为1∶10 000, 室温孵育2 h，加入显色液，于凝胶成像仪器曝光。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 bFGF促进脊髓损伤大鼠后肢功能恢复

模型组BBB评分明显低于假手术组(P<0.05)，bFGF 干预组BBB评分显著回升(P<0.05)(图1A)。

脊髓损伤后3 d，模型组可见损伤区及邻近区有出血的现象，并且部分细胞溶解消失，局部有空泡形成，灰质中心明显坏死、轴索紊乱不规则(图1B)。模型组神经元明显丢失，而给予bFGF后，相比较模型组，bFGF干预组脊髓组织病理结构明显改善，神经元丢失减少(图1C,D)。

2.2 bFGF促进大鼠脊髓损伤后BSCB的修复

脊髓损伤后，伊文思蓝的渗透迅速增加，术后1 d达到顶峰，之后慢慢下降。术后0.25、1、3和7 d，与模型组相比，bFGF干预组伊文思蓝的渗透明显减少(图2B)；术后1 d，脊髓直观图(图2A)以及纵切的荧光图(图2C)结果显示，bFGF干预组大鼠脊髓损伤周围染料的扩散量明显比模型组少。术后1 d，bFGF干预组FITC-dextran的渗透明显比模型组少(图2D)。

2.3 bFGF促进脊髓损伤后黏附连接蛋白和紧密连接蛋白的表达

与假手术组相比，模型组黏附连接蛋白(p120-catenin，β-catenin)和紧密连接蛋白(occludin，claudin- 5)均显著下调，且在损伤1 d后表达最低，其中β-catenin和occludin在第7天发生上调，而p120-catenin和claudin- 5的表达在第7天仍处于低水平状态(图3A,B)。与模型组相比，bFGF干预组以上4个蛋白表达均显著上升(图3C，D)。

3 讨论

对于脊髓损伤的治疗，之前的研究大多关注于损伤后后肢感觉和运动功能的恢复，主要涉及神经元的保护，忽视微血管的反应。在创伤性大鼠脊髓损伤模型中发现， 减少BSCB的破坏可以起到显著

A.BBB scores of SCI model rat at 1, 3, 7 and 14 days after contusion；*P<0.05，**P<0.01 compared with the SCI group; B.HE staining results of SCI rat at 3 days after contusion; C.NeuN staining results of SCI rat at 3 days post injury; D.quantification of the number of neuron index;*P<0.05 compared with the sham group；#P<0.05 compared with the SCI group

A.representative whole spinal cords showing Evans blue dye permeabilized into the spinal cord at 1 day; B.quantification of Evans blue dye extracted from spinal cord at 6 hours-14 days postinjury with or without bFGF; C.representative confocal images of sham, SCI, and bFGFgroups; D.quantification of the FITC-dextran extravasation;*P<0.01 compared with sham group；#P<0.05，##P<0.01 compared with SCI group

A.protein levels of p120-catenin, β-catenin,occludin, and claudin- 5 at 6 hours-7 days after injury; B.densitometric analyses of p120-catenin, β-catenin,occludin, and claudin- 5 of figue A; C.protein levels of p120-catenin, β-catenin,occludin, and claudin- 5 proteins 1 d after bFGF treatment; D.densitometric analyses of p120-catenin, β-catenin,occludin, and claudin- 5 of figue C;*P<0.05 compared with sham group；#P<0.05 compared with the SCI group

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