羟基红花黄色素A减轻大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤

沈冰冰，张 松，朱启仁，王志荣，张卓琦*

(1.徐州医科大学， 江苏 徐州 221000; 2.徐州医科大学附属医院 心内科， 江苏 徐州 221000)

随着冠状动脉搭桥术、经皮冠状动脉内成形术等血管再通术的迅速开展，冠心病再灌注治疗出现了一个飞跃。但心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)也成为阻碍缺血心肌从再灌注疗法获得最佳疗效的主要难题，如何减轻MIRI成为医学界新的挑战[1]。据报道激活磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路可以防止神经元凋亡和保护大脑免受缺血再灌注损伤[2]。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)通过PI3K依赖通路可以促进脑缺血后细胞的存活[3]。活化的Akt可以磷酸化几个下游靶标包括糖原合酶激酶3b(GSK3b)，该激酶在丝氨酸9(ser9)被Akt磷酸化并失活[4]。羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)是从化合物红花中分离获得的，具有各种生物活性，包括抗氧化、抗炎性反应作用、抗血小板聚集、抗肿瘤和抗心肌损伤作用[5]。研究表明HSYA可通过抑制线粒体通透性转换孔的开放保护大鼠心肌细胞I/R损伤[6]。

本实验进一步探讨是否可以通过调控PI3K/Akt/GSK3β信号通路保护心肌细胞缺氧/复氧(anoxia/reoxygenation，A/R)损伤。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

清洁级新生1～3 d的SD大鼠乳鼠，雌雄不限[徐州医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(苏)2015- 0009]。HSYA(大连美仑公司，批号A1228AS,HPLC≥98%)，Ⅰ型胶原酶(Sigma公司)；高糖DMEM培养基、胎牛血清(Gibco公司)；total Akt, phospho-Akt (Ser473), GSK3β 和 phospho-GSK3β(Ser9)一抗(CST)，Bax、Bcl- 2一抗(Santa Cruz公司)和兔β-actin抗体(Bioworld公司)，二抗(碧云天公司)；凋亡检测试剂盒(南京凯基公司)；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(南京建成公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞分离培养及分组处理：分离大鼠的乳鼠心肌细胞，孵育48 h，待细胞贴壁后，分为：对照组(Con组)、缺氧复氧组(A/R组)、HSYA处理组(A/R+H组)、 PI3K抑制剂(LY294002)处理组(A/R+L组)和HSYA+ LY294002处理组(A/R+H+L)。正常对照组细胞一直置于CO2培养箱中。A/R组行缺氧10 h，复氧2 h。HSYA加药处理组在缺氧液中加入20 μmol/L HSYA[7]，LY294002处理组在缺氧液中加入10 μmol/L LY294002[7]。

1.2.2 细胞培养上清液LDH释放量的测定：根据LDH试剂盒操作步骤进行，用酶标仪在450 nm测各组A值，带入公式算出LDH含量(U/L)。

1.2.3 流式检测细胞凋亡：参照细胞凋亡检测试剂盒使用说明操作，用流式细胞仪检测。

1.2.4 Western blot检测Bcl- 2、Bax、 Akt和p-Akt(Ser473)、GSK3β和p-GSK3β(Ser9)的蛋白表达水平：分组处理完毕后收集各组细胞，加入细胞裂解液，收集蛋白；经BCA法测浓度后，行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS．PAGE)，按半干转方法转移至PVDF膜，封闭后，加入一抗4 ℃孵育过夜，洗膜后二抗室温孵育1 h，再洗膜后，显色。用Image J图像分析蛋白条带。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 HSYA可降低各组的LDH释放量

与对照组比较，A/R后LDH的释放量增加(P<0.001)，与A/R组比较，A/R+H组LDH释放量降低(P<0.001)，与A/R+H组比较， A/R+L组、A/R+H+L组LDH释放量增加(P<0.001)(图 1)。

*P<0.001 compared with the Con group；#P<0.001 compared with the A/R group； ΔP<0.001 compared with the A/R+H group图1 原代心肌细胞LDH释放量的改变Fig 1 Change in the LDH release of primary cardiomy-

2.2 HSYA处理可降低A/R后心肌细胞的凋亡率

与对照组比较，A/R后细胞的凋亡率增加(P<0.001)；与A/R组比较，A/R+H组凋亡率降低(P<0.001)，与A/R+H组比较，A/R+L组、A/R+H+L组细胞凋亡率增加(P<0.001)(图2)。

2.3 Western blot检测Bcl- 2、Bax、 Akt、p-Akt(Ser473)、GSK3β和p-GSK3β(Ser9)的蛋白表达水平

2.3.1 A/R后各实验组凋亡相关蛋白表达水平的比较：与对照组相比，A/R后促凋亡蛋白Bax表达增加(P<0.001)，而抗凋亡蛋白Bcl- 2表达减少(P<0.001)；与A/R组相比，A/R+H组Bax蛋白表达减少(P<0.001)，而Bcl- 2蛋白表达增加(P<0.001)；与A/R+H组比较，A/R+H+L组Bax蛋白表达增加(P<0.001)，而Bcl- 2蛋白表达明显减少(P<0.001)(图3，4)。

2.3.2 A/R后各实验组Akt和p-Akt(Ser473)、GSK3β和p-GSK3β(Ser9)蛋白表达水平的比较:与对照组相比，A/R后p-Akt(Ser473)、p-GSK3β(Ser9)蛋白表达减少(P<0.001)；与A/R组相比，A/R+H组p-Akt(Ser473)、p-GSK3β(Ser9)蛋白表达增加(P<0.001)；与A/R+H组比较，A/R+H+L组p-Akt(Ser473)、p-GSK3β(Ser9)蛋白表达降低(P<0.001)(图5，6)。

3 讨论

心血管疾病是全世界死亡的主要原因，并且仍然是现代社会的主要杀手之一。它可以由多种因素启动，包括缺血/再灌注损伤。细胞凋亡是细胞死亡的生理过程，在各种生物系统中发挥关键作用，这一直是被认为为缺血/再灌注损伤的启动和进展提供了重要的分子基础[8]。红花黄色素是从红花的花瓣中提取出的天然黄色素，为查耳酮类化合物。研究发现红花黄色素具有扩张冠状动脉、改善心肌缺血、抑制血栓形成、抑制细胞凋亡、抗氧化、抗感染和脑保护[9]等多种药理功能。HSYA是红花黄色素的主要成分，研究发现，在大鼠中，HSYA可通过PI3K/Akt/GSK3β信号通路发挥抗凋亡作用来保护脑缺血再灌注损伤[10]。但PI3K/Akt/GSK3β信号通路在心肌细胞中的具体作用机制，目前尚无报道，本实验通过培养原代心肌细胞模拟MIRI损伤来研究该通路在心肌细胞中的作用机制。实验中通过检测各组细胞的上清液的LDH的释放量和各组细胞的凋亡率，结果显示A/R后LDH释放量和凋亡率增加，而加用HSYA处理后，LDH和凋亡率降低，而加入PI3K的抑制剂LY294002后这种作用消失，表明HSYA可减少心肌细胞的凋亡，而这种保护作用可能是通过PI3K这条途径发挥作用的。

*P<0.001 compared with the Con group；#P<0.001 compared with the A/R group； ΔP<0.001 compared with the A/R+H group

*P<0.001 compared with the Con group；#P<0.001 compared with the A/R group；ΔP<0.001 compared with the A/R+H group图3 各组凋亡蛋白Bax表达水平的比较Fig 3 Comparision of the protein expression of

*P<0.001 compared with the Con group；#P<0.001 compared with the A/R group；ΔP<0.001 compared with the A/R+H group图4 各组凋亡蛋白Bcl- 2表达水平的比较Fig 4 Comparision of the protein expression of

*P<0.001 compared with the Con group；#P<0.001 compared with the A/R group；ΔP<0.001compared with the A/R+H group

*P<0.001 compared with the Con group；#P<0.001 compared with the A/R group；ΔP<0.001compared with the A/R+H group

本实验结果显示A/R后促凋亡蛋白Bax表达增多，而抗凋亡蛋白Bcl- 2表达减少；HSYA处理后，可减少促凋亡蛋白表达，增加抗凋亡蛋白表达；而加入抑制剂LY294002后， HSYA的抗凋亡作用消失，表明HSYA可减少心肌细胞的凋亡，并且是通过激活PI3K这条通路发挥作用的。

PI3K/Akt是细胞内重要的信号传导通路之一,其在细胞的凋亡、存活、增殖以及细胞骨架的变化等中发挥着重要的生物学功能。PI3K下游有多种效应分子，Akt 处在这一通路的中心环节，是 PI3K 直接靶点和最主要的靶酶。只有磷酸化的 Akt才能发挥抗凋亡蛋白合成及促细胞生存等功能[11]。一项研究显示在HSYA诱导的脑缺血再灌注损伤抗凋亡作用中，GSK3β是PI3K/Akt信号通路的一个重要的下游因子[10]。本实验Western blot检测表明， A/R后Akt(Ser473)、p-GSK3β(Ser9)蛋白表达明显减少；而经HSYA处理后，p-Akt(Ser473)、p-GSK3β(Ser9)蛋白表达增加，加入抑制剂LY294002后该作用消失，证实HSYA的这种保护作用可能是通过激活PI3K/Akt/GSK3β这条通路发挥的。

[1] 刘伊娜, 朱健华, 吴翔, 等.羟基红花黄色素A抗心肌细胞缺氧复氧损伤的线粒体相关机制[J].江苏大学学报(医学版),2013,23:313- 316.

[2] Zhang J, Deng Z, Liao J,etal.Leptin attenuates cerebral ischemia injury through the promotion of energy metabolism via the PI3K/Akt pathway[J].J Cereb Blood Flow Metab,2013,33:567- 574.

[3] Cantley LC.The phosphoinositide 3-kinase pathway[J].Science,2002,296:1655- 1657.

[4] Martin M, Rehani K, Jope RS,etal.Toll-like receptor-mediated cytokine production is differentially regulated by glycogen synthase kinase 3[J].Nat Immunol,2005,6:777- 784.

[5] Wu Y, Wang L, Jin M,etal.Hydroxysafflor yellow A alleviates early inflammatory response of bleomycin-induced mice lung injury[J].Biol Pharm Bull,2012,35:515- 522.

[6] Liu YN, Zhou ZM, Chen P.Evidence that hydroxysafflor yellow a protects the heart against ischaemia-reperfusion injury by inhibiting mitochondrial permeability transition pore opening[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2008,35:211- 216.

[7] 许爱斌，刘建国，张健，等.羟基红花黄色素A对心肌细胞缺血_再灌注损伤的保护作用[J].中国循证心血管医学杂志,2015,7:663- 665.

[8] Pratap J, Imbalzano KM, Underwood JM,etal.Ectopic runx2 expression in mammary epithelial cells disrupts formation of normal acini structure: implications for breast cancer progression[J].Cancer Res,2009,69:6807- 6814.

[9] 杨晓媛，任玉芳.红花黄色素药理作用研究进展[J].热带医学杂志,2015,15:421- 424.

[10] Chen L, Xiang Y, Kong L,etal.Hydroxysafflor yellow A protects against cerebral ischemia-reperfusion injury by anti-apoptotic effect through PI3K/Akt/GSK3beta pathway in rat[J].Neurochem Res,2013,38:2268- 2275.

[11] 李钢，杨双强.PI3K/Akt通路在硫化氢后处理保护心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用[J].第三军医大学学报,2011,33:1803- 1807.