Brown-Norway大鼠咳嗽变异性哮喘模型的建立

楚慧伦，孔德明，丁子桐，高琴琴，续 艳，阎 玥，李友林，孙文燕*

(1.北京中医药大学中药学院，北京 100102； 2.中日友好医院国家中医药管理局肺病慢性咳嗽重点研究室，北京 100102)

咳嗽变异性哮喘(cough variant asthma，CVA)是一种特殊类型的哮喘，临床主要表现为慢性持续性干咳[1]，通常咳嗽比较剧烈，以夜间咳嗽为其重要特征，但无明显喘息、气促等症状或体征。感冒、冷空气、灰尘、油烟等容易诱发或加重咳嗽[2]。有研究表明，CVA是典型哮喘的前驱，约有30%的患者随着接触变应原时间的增长而发展为典型哮喘[3-4]，严重威胁公众健康。

CVA的发病机制与典型哮喘的发病机制相似[5]，主要与变应原致敏、气道慢性炎性反应、气道高反应性和气道重塑等密切相关。研究表明气道慢性炎症是各型各期哮喘病的共同病理学特征，是气道可逆性阻塞和非特异性气道高反应性的重要决定性因素，炎症的轻重反映哮喘病情的轻重。

Brown-Norway(BN)大鼠是高免疫球蛋白(尤其是IgE)应答品系[6]，更易诱发出CVA症状以及气道变应性炎症与气道高反应性，而目前我国常用的SD大鼠、Wistar大鼠等稳定性欠佳。故本研究拟用卵蛋白(ovalbumin，OVA)腹腔注射加雾化激发的方法，建立一种简便易行的咳嗽变异性哮喘BN大鼠模型，并使用临床常用的咳嗽变异性哮喘治疗药物孟鲁斯特钠作为阳性药，以评价模型的适用性。

1 材料和方法

1.1 实验动物

Brown-Norway(BN)大鼠36只，SPF级，雌雄各半，体重180～200 g，8周龄左右，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供 [SCXK (京) 2016-0011]。动物饲养于中日友好医院屏障环境中[SYXK (京) 2016-0043]，温度22℃～24℃，湿度44%～50%。

1.2 主要试剂与仪器

顺尔宁片(孟鲁斯特钠)，杭州默沙东制药有限公司，产品批号：N007972；卵清白蛋白(卵蛋白，OVA)：美国Sigma公司，批号：09/2017；辣椒素：美国Sigma公司，批号：MKBN8613V；溴化乙酰胆碱，东京化成工业株式会社，批号：JQTEN-BD；戊巴比妥钠，德国Merck公司，生产批号：08/2017。

A02AI超声波雾化器：上海鱼跃医疗设备有限公司；AniRes2005动物肺功能分析系统：北京贝兰博科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 模型的制备及分组给药

大鼠随机分成三组(正常对照组、模型对照组、给药组)。第1日腹腔注射2 mg卵蛋白(OVA)和100 mg Al(OH)3，3周后再次腹腔注射0.01 mg OVA及100 mg Al(OH)3，正常对照组注射等量生理盐水。3周后模型对照组和给药组开始用1% OVA进行雾化攻击，正常对照组用生理盐水，隔日一次，共7次。雾化当天开始给药，在雾化前30 min给药组进行孟鲁斯特钠(1.3 mg/kg)灌胃给药，模型对照组与正常对照组灌胃等量饮用水，每天一次，共14次。本实验方案经过中日友好医院实验动物福利伦理委员会审查，符合动物保护、动物福利和伦理原则，符合国家实验动物福利伦理相关规定，编号：170101。本实验实施过程中严格遵守动物使用的3R原则。

1.3.2 辣椒素引咳实验

最后一次给药24 h后，各组大鼠置于雾化箱内，雾化吸入10-4mol/L辣椒素溶液60 s，记录2 min内各组大鼠的咳嗽次数。

1.3.3 肺功能测定(激发实验)

将各组大鼠以2%戊巴比妥钠80 mg/kg腹腔注射麻醉，行气管有创插管，仰卧于小动物呼吸机的密闭体描箱内，气管插管与体描箱相连，观察气道压力波形正常后，建立颈总静脉给药通路，保证通路顺畅后关闭体描箱，待气道压力曲线平稳后，每隔5 min依次输入以下四个剂量的乙酰甲胆碱：0.025 mg/kg、0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、0.2 mg/kg。检测用药后大鼠吸气总气道阻力(RL)和动态顺应性(Cdyn)。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 辣椒素引咳实验

与正常对照组比较，模型对照组咳嗽次数显著增多(P< 0.01)；与模型对照组比较，给药组的咳嗽次数显著减少(P< 0.05)，说明模型对照组对辣椒素的刺激更加敏感(见表1)。

2.2 肺功能(激发实验)测定

2.2.1 吸气总气道阻力(RL)

第一次激发，各组之间差异无显著性(P> 0.05)。第二次激发，与正常对照组比较，模型对照组RL显著上升(P< 0.05)；与模型对照组比较，给药组RL显著下降(P< 0.01)。第三次激发，与正常对照组比较，模型对照组RL显著上升(P< 0.05)；与模型对照组比较，给药组RL显著下降(P< 0.05)。第四次激发中，与正常对照组比较，模型对照组RL显著上升(P< 0.05)(见表2)。说明模型对照组吸气气道阻力明显高于正常对照组。

2.2.2 动态顺应性(Cdyn)

与正常对照组比较，模型对照组Cdyn在第二、三次激发中显著下降(P< 0.05)，在第四次激发中也显著下降(P< 0.01)。与模型对照组比较，给药组Cdyn在第二次(P< 0.01)、第三次(P< 0.05)、第四次(P< 0.01)激发中均显著上升，说明模型对照组肺动态顺应性明显低于正常对照组，而孟鲁斯特钠可以有效缓解这一症状(见表3)。

Tab.1Comparison of times of coughing

组别Groups大鼠数量Numberofrats咳嗽次数Timesofcoughing正常对照组Normalcontrolgroup12367±223模型对照组Modelgroup111233±656∗∗孟鲁斯特钠组Montelukastgroup12492±231△

注：与正常对照组比较，**P< 0.01；与模型对照组比较，△P< 0.05。

Note. Compared with the normal control group,**P< 0.01. Compared with the model group,△P< 0.05.

Tab.2Comparison of RLin the test of bronchial responsiveness

组别Groups大鼠数量Numberofrats第一次激发Firstexcitation第二次激发Secondexcitation第三次激发Thirdexcitation第四次激发Fourthexcitation正常对照组Normalcontrolgroup12055±010054±009056±011055±006模型对照组Modelgroup11063±016065±008∗069±011∗079±025∗孟鲁斯特钠组Montelukastgroup12057±010050±005△△056±007△060±009

注：与正常对照组比较，*P< 0.05，**P< 0.01；与模型对照组比较，△P< 0.05，△△P< 0.01。

Note. Compared with the normal control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the model group,△P< 0.05,△△P< 0.01.

Tab.3Comparison of Cdynin the test of bronchial responsiveness

组别Groups大鼠数量Numberofrats第一次激发Firstexcitation第二次激发Secondexcitation第三次激发Thirdexcitation第四次激发Fourthexcitation正常对照组Normalcontrolgroup12012±002012±002012±002012±002模型对照组Modelgroup11011±003009±003∗009±004∗008±003∗∗孟鲁斯特钠组Montelukastgroup12013±002013±001△△013±002△012±001△△

注：与正常对照组比较，*P< 0.05，**P< 0.01；与模型对照组比较，△P< 0.05，△△P< 0.01。

Note. Compared with the normal control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the model group,△P< 0.05,△△P< 0.01.

3 讨论

咳嗽变异性哮喘(cough variant asthma，CVA)是以慢性咳嗽为惟一或主要临床表现，不伴有明显喘息的一种特殊类型的支气管哮喘，又称为咳嗽型哮喘、隐匿型哮喘或过敏性咳嗽。患者具有气道高反应性和气道炎症等病理特征，其气道高反应性的程度与典型哮喘患者相似或略低，但CVA患者的呼吸道狭窄症状并没到引起喘息的程度，故只出现咳嗽而没有喘息症状，并且在支气管激发试验吸入乙酰胆碱的过程中，CVA主要表现为咳嗽，喘息的发生率明显较低[7]。有研究显示，CVA患者与典型哮喘患者相比，在生活中更加焦虑、压力更大[8]，严重危害公众健康，为了提高CVA疾病的治疗效果，CVA动物模型的研发必不可少。

CVA的发病机制与哮喘相似，因此两者的动物模型都主要通过卵蛋白(OVA)致敏造模。而CVA造模多用Al(OH)3作为佐剂，哮喘多采用OVA联合百日咳的造模方法[9]。且因CVA的主要临床表现为咳嗽，所以实验中往往加入辣椒素引咳的内容，其结果也是证明模型成功与否的重要指标。

目前CVA动物模型的复制，国际上多使用Brown-Norway(BN)大鼠，而国内常用的SD大鼠、Wistar大鼠等稳定性欠佳，在国际上很难被认可。且有研究显示，BN大鼠在致敏原的激发下，能产生较高水平的特异性IgE、IgG抗体，具有较强的致敏免疫反应[10]，与CVA临床症状接近。本研究即是在传统CVA动物模型复制方法的基础上[11-14]，通过采用BN大鼠，建立一种简便易行的CVA动物模型。

实验中辣椒素引咳结果显示，模型对照组咳嗽次数明显高于正常对照组，给药组咳嗽次数明显少于模型对照组，说明模型对照组对辣椒素的刺激更加敏感，符合CVA患者在外界因素刺激下咳嗽加剧的症状。

气道高反应性是CVA重要的生理学改变，也是诊断的重要指标[15]，本实验采用有创肺功能检测方法，观察乙酰甲胆碱激发实验中BN大鼠的RL和Cdyn趋势。结果显示，第一次激发中各组之间RL和Cdyn差异均无显著性，从第二次激发开始，模型对照组的RL上升程度和Cdyn下降程度都明显超过正常对照组，给药组RL上升幅度和Cdyn下降幅度都明显小于模型对照组。提示模型对照组肺功能明显低于正常对照组，而孟鲁斯特钠缓解了这一症状，与临床实验结果[16-17]接近。

本研究结果显示，模型对照组的咳嗽症状和气道高反应性符合CVA的临床症状，故所建立的BN大鼠咳嗽变异性哮喘模型与CVA患者的基本特征接近，可用于CVA治疗药物的干预性研究，而其生化及免疫反应特征尚有待于进一步研究。

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