高糖对人脐静脉内皮细胞CD26的表达及MBL补体途径的影响及作用机制

潘 登，颜晓勇

(1.中山大学附属东华医院 风湿免疫科，广东 东莞 523000；2.遵义医学院附属医院 肾病风湿科，贵州 遵义 563099)

糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病的主要并发症及死亡原因之一。最近研究证明，炎性反应在DN的发病机制中起关键作用[1-2]。CD26是一种分布于内皮细胞、肾小管上皮细胞及T细胞等多种细胞的跨膜糖蛋白[3]，其可与甘露糖结合凝集素(Mannan binding lectin，MBL)相结合[4-5]，与DN的发生发展密切相关[6]。本实验通过检测高糖刺激下体外培养的人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)的CD26、MBL、C3、MAC及IL-6和NF-kB的表达，探讨CD26对人脐静脉内皮细胞MBL补体途径及微炎症状态的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂 人脐静脉内皮细胞(ATCC，美国)，低糖DMEM培养基(Gibco，美国)，兔抗人CD26多克隆抗体(ab28340)，兔抗人MBL单克隆抗体(ab133629)，兔抗人C5b-9多克隆抗体(ab55811)，兔抗人C3多克隆抗体(ab97462)(Abcam公司，美国)，人CD26引物，人IL-6引物，人NF-kB引物(四川生工科技有限公司)，RNA逆转录试剂盒(TAKARA公司，大连)等。

1.2 主要仪器 超净工作台(苏州净化有限公司)，二氧化碳培养箱(Thermo，美国)，离心机(Eppendorf，德国)，高压蒸汽灭菌器(SANYO，日本)，pH滴定仪(Jenway，美国)，酶标仪(LISTEO，美国)，Realtime PCR扩增仪(Biorad，美国)等。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组 对照组(加入葡萄糖5.5 mmol/L)；高渗组(加入葡萄糖5.5 mmol/L和甘露醇24.5 mmol/L)；高糖组(加入葡萄糖30 mmol/L)。

1.3.2 免疫组化法检测细胞的CD26、MBL、C3和MAC的表达 将分组培养的细胞加入4%多聚甲醛固定30 min，设PBS组为阴性对照，加入一抗(CD26 1∶200、MBL 1∶100、C3 1∶100、MAC 1∶200)，孵育24 h，复温，吸走一抗，加入1∶200的组化二抗，37 ℃孵育30 min后，显色，返蓝，封片剂封片。于显微镜下观察各组蛋白表达。

1.3.3 Western Blot检测HUVEC的CD26、MBL、C3及MAC的蛋白水平量 将分组培养的细胞离心后加入裂解液、酶抑制剂及蛋白抽提试剂，离心取上清。用BCA蛋白质定量试剂盒，制作标准曲线，并根据OD值计算待测样品蛋白浓度。配胶、转膜，以GAPDH为内参，加入一抗(CD26 1∶1 000、MBL 1∶1 000、C3 1∶2 000、MAC 1∶200)，后用TBST清洗加入二抗室温孵育2 h。用化学发光法显影，并用Image J图像分析软件行灰度值分析。

1.3.4 qRT-PCR检测细胞中CD26、IL-6和NF-kB mRNA表达 将分组培养的细胞离心分离后，加入Trizol裂解细胞，后移至EP管中，静置后离心，取上清加0.5 mL异丙醇混匀离心，加1 mL预冷的75%乙醇震荡后，离心弃上清，加0.1%DEPC水50 μL吹打至溶解，提取总RNA，配制qRT-PCR的反应体系，扩增目标基因。qRT-PCR引物序列见表1。反应条件：第1步：95 ℃预变性2 min；第2步：95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s；第3步：72 ℃延伸1 min， 40个循环。以Ct值为统计参数，按2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达情况。

表1 qRT-PCR引物序列

GeneSequenceIDForwardprimerReverseprimerCD26NM_001935.3AAGTGGCGTGTTCAAGTGTTCTTCTGGAGTTGGGAGACIL-6NM_000600.3CTTCGGTCCAGTTGCCTTCTGTGAGTGGCTGTCTGTGTGNF-kBNM_001165412.1CTGAGTCCTGCTCCTTCCAACTTCGGTGTAGCCCATTTGTβ-actinNM_001101.3TGGCACCCAGCACAATGAACTAAGTCATAGTCCGCCTAG

2 结果

2.1 免疫组化法及Western Blot检测HUVEC的CD26、MBL、C3、MAC的蛋白表达 在HUVEC中CD26、MBL、C3、MAC主要表达于胞膜和胞浆，见图1。与对照组及高渗组相比，高糖组CD26、MBL、C3及MAC的蛋白相对表达量均明显增高(P<0.05，见图2，表2)。

A:CD26;B:MBL;C:C3;D:MAC。图1 各指标的免疫组化表达(200×)

图2 各组各指标的蛋白印迹图

组别蛋白表达量CD26MBLC3MAC对照0.71±0.090.56±0.120.71±0.060.45±0.05高渗0.59±0.030.78±0.090.81±0.090.54±0.09高糖1.20±0.05■▼1.22±0.03■▽1.19±0.05■▼0.78±0.04■▽

与对照组比较：■P<0.01；与高渗组比较：▽P<0.05，▼P<0.01。

2.2 qRT-PCR检测HUVEC的CD26、IL-6和NF-kB mRNA表达 与对照组及高渗组相比，高糖组CD26、IL-6、NF-kB的mRNA相对表达量均增加(P<0.05，见表3)。

组别mRNA的表达量CD26IL-6NF-kB对照0.40±0.080.08±0.052.81±1.03高渗0.25±0.060.05±0.062.09±0.79高糖0.78±0.15□▼0.25±0.10□▼11.97±2.02□▽

与对照组比较：□P<0.05；与高渗组比较：▽P<0.05，▼P<0.01。

2.3 相关性分析

2.3.1 CD26 Western Blot蛋白表达量与MBL呈正相关(r=0.825，P<0.01)；与C3呈正相关(r=0.869，P<0.01)；与MAC亦呈正相关(r=0.828，P<0.01)。

2.3.2 CD26的qRT-PCR mRNA相对表达量与IL-6呈正相关(r=0.858，P<0.01)；与NF-kB亦呈正相关(r=0.794，P<0.05)。

3 讨论

DN是终末期肾病的主要病因及死亡原因之一[7]，是多种发病机制综合作用的结果。因此，研究DN的发生发展机制及其相关治疗方案，将为人类的健康带来巨大收益。CD26作为一种重要的促炎细胞因子可以与MBL相结合，进而激活甘露糖结合凝集素补体途径[8]，介导相关炎症反应的发生，进而引起肾脏细胞及组织的损伤[9]。

本实验免疫组化结果显示：在HUVEC中CD26、MBL、C3、MAC主要表达于胞膜和胞浆。Western Blot结果显示：与对照组及高渗组相比较，高糖组人脐静脉内皮细胞CD26、MBL、C3、MAC的蛋白表达量是升高的(P<0.05)，而对照组与高渗组相比较，各指标蛋白表达量均无统计学意义(P>0.05)，CD26分别与MBL、C3、MAC蛋白表达量呈明显正相关(P值均<0.01)。由此可以看出，高糖条件下，HUVEC的CD26表达增高，其作为MBL的配体与其相结合，激活甘露糖结合凝集素补体途径，进而介导炎症反应的发生，引起细胞及组织的损伤。

qRT-PCR结果显示：与对照组及高渗组相比较，高糖组HUVEC中CD26、IL-6、NF-kB的mRNA表达量是升高的(P<0.05)；对照组与高渗组相比较，各指标mRNA的相对表达量均无统计学意义(P>0.05)。且CD26分别与IL-6、NF-kB的mRNA表达量呈正相关(P值均<0.05)。由此我们可以得出：高糖作用下，细胞的CD26、IL-6、NF-kB mRNA的相对表达量是增加的，CD26除了通过激活MBL补体途径，促进和扩大后续炎症反应外，也可能通过直接作用于致炎因子IL-6及NF-kB，从而加重炎症反应的发生，引起肾组织的损伤。

本实验研究了高糖作用下的HUVEC中MBL补体激活途径对细胞炎症反应的影响及其作用机制。而CD26作为一个具备免疫调节作用的粘附分子，在此炎症反应的发生发展过程中占据着重要地位。人脐静脉内皮细胞在高糖作用下细胞内的CD26的表达量是升高的。而大量的CD26可通过激活细胞内的甘露糖结合凝集素补体途径，介导炎症因子IL-6、NF-kB的产生。另外，CD26还有可能通过作用于内肽酶Meprin β及高迁移率族蛋白1等多种蛋白[10-11]，使细胞中炎症因子IL-6及NF-kB的表达增加，加重DN者的组织损伤。目前，CD26对DN炎症状态的影响及作用机制还有待于进一步研究。

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