单克隆抗体生产中CHO细胞培养工艺研究进展

李未思

（四川大学生物治疗国家重点实验室，四川成都 610000）

CHO细胞（中华仓鼠卵巢细胞，Chinese Hamster Ovary Cells）是广泛应用的哺乳动物细胞表达系统，目前已上市、进入临床和临床前研究阶段的大部分治疗性单克隆抗体采用该表达系统进行生产。用于生产过程的细胞培养工艺应能持续稳定地生产出质量一致的合格产品，同时具有较好的生产效率和效益。细胞培养结束后，收获液经纯化工序制得原液，原液需根据相关法规要求，以及基于产品安全性和有效性的风险评估来确定其关键质量属性（Critical Quality Attributs，CQAs）。其中，与细胞培养工艺密切相关的关键质量属性检测项目有抗体蛋白质结构、糖型分布、聚体情况、电荷变异情况、宿主蛋白/DNA含量等。收获液中上述项目相关杂质的含量多寡直接影响纯化工序的难度和收率，其中不同糖型的抗体在现有生产工艺中很难有效分离，因此，杂质的含量必须从细胞培养工序中加以控制。在保障抗体质量的前提下，应同时提高抗体表达量、抗体生成速率、细胞活性密度至合适程度，优化操作参数和流程，以提高生产过程的效率、稳定性和安全性。本文从上述角度出发，对CHO细胞培养工艺中的主要影响因素和需要注意的问题进行探讨。

1 培养基

培养基是CHO细胞生长、产物表达的物质基础，培养基的选择应充分考虑细胞株种系特点和产品要求。根据加入时机及目的不同，培养基可分为基础培养基和补料培养基，其中基础培养基主要用于细胞早期增殖阶段，补料培养基主要用于早期增殖和表达阶段，应根据不同阶段细胞的营养需求和代谢来选择相应的培养基。同时，化学成分确定、无动物来源、无蛋白已成为当今培养基的发展趋势，可带来安全性、稳定性以及法规方面的优势和便利。

目前，已有多种商品CHO细胞培养基，可满足不同细胞系、生产阶段的需求，同时，定制培养基也已投入生产应用。与非定制的商品培养基相比，定制化培养基可针对具体细胞株进行精准优化，且生产企业掌握配方，可灵活选择各有资质的厂家进行定制，达到提高产品质量与产量，降低培养基成本，提高供应源稳定性的目的。

有多种途径进行培养基的优化。（1）采用混料设计，直接采用商品培养基进行混料实验，可在较短时间内筛选出较好的组合；（2）向培养基内添加氨基酸、生物因子、维生素、微量元素等物质，从中选取对所考察质量属性有较大影响的物质，并进行下一步优化；(3)对培养基成分及细胞代谢进行分析，从营养物质缺失和代谢废物累积两方面明确限制因子，针对性补加或设法清除相关物质，并可通过细胞代谢特点确定补料策略，以及定制培养基各成分比例[1-2]。同时，应考察培养基成分对抗体质量属性，如糖型等的影响[3]。在小规模高通量系统中完成初步优化后，应在中试生物反应器中进行验证，以确认新配方在生产中的适用性。

2 培养参数

CHO细胞培养的主要培养参数有温度、pH、转速、溶氧等。现有CHO细胞培养工艺广泛采用变温培养，即细胞生长增殖及产物表达阶段采在不同温度下培养。一般在指数生长后期降低培养温度，可调节细胞周期，延缓细胞死亡，提高抗体生成速率，延长培养时间，达到提高总表达量的效果。与变温培养类似，也可对pH进行调节，使细胞代谢方式从增殖阶段向产物表达阶段转变。需要注意的是，温度和pH的变化可影响抗体的糖型、聚体、电荷变异等方面，需进行相应的考察[4-6]。

大多数现有CHO细胞单抗生产平台使用搅拌式生物反应器进行产物表达。在培养过程中，搅拌式生物反应器通过搅拌桨搅拌和气体分布器通气进行传质，来满足细胞对氧气的需求，同时去除多余的二氧化碳，维持反应器内各处温度、溶氧、pH、营养物质浓度等培养条件的均一性。然而，过大的搅拌和通气速率会对细胞造成剪切伤害，降低密度和活性，影响产物质量，尤其是在大型生物反应器中，维持足够的氧气传递系数和较短的混合时间的同时，应充分考虑剪切伤害。

反应器培养中CHO细胞所受到的剪切伤害主要来自搅拌桨的机械挤压，培养液中的涡旋和气泡破裂产生的表面张力。为避免机械挤压和涡旋的剪切伤害，桨尖速度不应超过CHO细胞的耐受值；涡旋的最小尺度（即Kolmogorov尺度）应大于细胞的最大直径，以避免细胞在多个涡旋之间受到切向剪切。桨尖速度与搅拌转速成正相关，Kolmogorov尺度与搅拌转速成负相关，因此需将转速控制在一定范围内。气泡破裂产生的表面张力可杀死附着在其表面的细胞，加入表面活性剂可减少气泡表面的细胞附着；适当的通气量和气泡尺寸也能降低气泡破裂的影响，但受制于气体分布器的规格尺寸和反应器的混合性能，因此在配置设备时应及早结合工艺进行考察。

3 工艺放大

由于时间及成本的原因，反应器培养工艺实验一般先在小型反应器中进行，再逐步放大至中试及生产规模。同时，可以使用小型反应器模拟现有大规模生产中的部分工艺参数，即为缩小模型[7]。工艺放大过程中，应确保抗体关键质量属性及表达量、细胞密度、活性等主要指标的稳定性。在不同的培养规模下，温度、pH、流加策略一般不进行改变，但搅拌速度和通气速率等因素受体积影响，需要遵循一定的变化准则。工艺放大/缩小通常采用相同单位体积功率P/V、传质系数kLa等作为准则。由于P/V ∝ P0N3D5，kLa∝ (P/V)αUgβ（其中 P0为搅拌桨功率数，N为搅拌转速，D为搅拌桨直径，Ug为通气速率，α、β为常数，由实验得出）[8]，当P/V或kLa取值固定时，可得出培养规模放大/缩小后的搅拌转速和通气速率。但正如前面提到的，搅拌转速和通气速率的取值必须考虑到细胞的耐受范围和反应器的硬件条件，同时，大型生物反应器培养中存在的传质不均一问题，可将两个小型反应器通过管路及蠕动泵串联，或通过在小型反应器上加装平推流反应器（Plug flow reactor，PFR）等装置[9]，模拟大型生物反应器不同区域之间物质的混合来进行考察。

4 结语

以CHO细胞为表达系统的大规模培养工艺在治疗性单克隆抗体生产过程中起着关键作用。由于大规模细胞培养的特殊性和复杂性，以及国家监管机构对生物制品质量要求日趋严格，生产厂家需要利用飞速发展的新技术和方法，开发高质量、高表达、高效率、可稳定生产的细胞培养工艺，以期在竞争日益激烈的治疗性单克隆抗体市场中脱颖而出。

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