一株胆固醇富集物中细菌的鉴定

金卓，蒋凯，金珂，梁晨，梁琳洁，丁滨

（浙江中医药大学，浙江杭州 310053）

随着经济的发展、人口的增长，城市污水、养殖业及相关制药产业垃圾等含有的固醇类化合物对生态平衡破坏的问题逐渐突显[1-2]。胆固醇、粪固醇、胆汁酸、甚至雌二醇等固醇类化合物已经被作为生物标志物来评价环境污染物的类型及污染程度[2-4]。据统计，每个人每天排出固醇类化合物的总量在0.2～1 g[3]。粪固醇的长侧链在化学或生物因素的作用下极易断裂，形成固醇类激素。2014年，Sistiaga和Goldberg等人从远古人类生活遗迹的化石中分离到了固醇类化合物[5]。加拿大学者跟踪调查的结果表明，此类化合物可在土壤中沉积超过1年[3]。

细菌细胞中缺乏固醇类化合物，却可以利用这类化合物作为唯一碳源生长繁殖。有研究证明，在有氧条件下，活性污泥中的微生物需要约20天才可以降解掉生活污水中的固醇类污染物，包括固醇类激素[3,6]。2003年，Tarlera和Denner从环境中分离到1株能够在反硝化条件下降解胆固醇的细菌，经鉴定发现其为β-变形菌门的一个新属，被命名为Sterolibacteriumdenitrificans Chol-1ST（DSMZ 13999）[7]，与已知能够降解单苯环类化合物的Thauera属和Azoarcus属[8]细菌的亲缘关系比较近。该细菌能够利用的碳源有限，目前发现它仅能利用胆固醇以及少量的结构类似物为碳源生长。该属至今仅有两个成员，另一株是尚未鉴定和命名的菌株72Chol[9]。丰富的研究对象是研究胆固醇在无氧环境中代谢过程的前提，笔者从以胆固醇为底物的生活污水富集物中分离到了一株细菌，并对该细菌进行了系统分类鉴定。

1 试剂及仪器

用于培养基配制的化学及生化试剂均购自华东医药股份有限公司（杭州），16s rDNA细菌鉴定PCR试剂盒由宝生物工程（大连）有限公司提供；PCR仪由美国伯乐公司提供；电泳仪（DYY-6B）购自北京市六一仪器厂；分光光度计（ZF-2）购于上海嘉鹏科技有限公司；生化培养箱由宁波海曙赛福实验仪器厂提供。

2 实验方法

2.1 细菌的无氧富集、分离与纯化

将土壤样品富集在以硝酸盐为电子受体、含1 g胆固醇的MS培养基中1年。将富集培养物混匀后连续梯度稀释纯化4次，显微镜下观察富集物中的细菌形态均一、一致。上述过程及使用的培养基均经过充CO2保持无氧环境。

2.2 克隆PCR及细菌分子生物学鉴定

将离心收集的菌泥重新悬浮于无菌水中，加热煮沸后迅速冰浴，反复两次使细胞溶解，制成细菌裂解液。加入含一对序列为27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和519R GWATTACCGCGGCKGCTG的引物的PCR反应体系中，依次经过94℃变性、55℃退火、72℃延伸，循环35次，体外扩增该菌落的16s rDNA序列。PCR反应产物经1%琼脂糖电泳检测，并由上海生物工程有限公司（上海）测序。获得的序列在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov网站进行比对分析。

2.3 革兰氏染色及细菌形态观察

以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照，先后经过结晶紫初染、碘液媒染、酒精脱色、番红复染4个步骤，干燥载玻片，在油镜下观察。

2.4 最适培养条件

（1）将细菌的新鲜培养物按1∶20比例分别接种于pH为4、5、6、7、8、9和10的MS培养基中，放入摇床中30℃、180 r/min培养，根据培养物OD600的变化判断细菌生长最适pH值。（2）将细菌接种于最适pH的MS培养基中，分别放置在20、30、40℃及50℃培养箱中培养，根据培养物OD600的变化判断细菌生长最适温度。（3）将细菌接种于含不同浓度梯度底物的培养基中，根据培养物OD600值的变化判断细菌生长最适底物浓度。以上实验每组各设重复3个。将细菌的新鲜培养物按1∶50比例接种于最适培养基中，于最适温度下摇床培养，并确保硝酸盐过量，在不同时间段取出培养物，测培养物OD600值，计算代时。

2.5 底物代谢能力实验

将细菌分别接种于含0.5%果糖、0.5%乳糖、0.5%棉子糖、0.5%葡萄糖、0.5%阿拉伯糖、0.5%木糖、0.5%乳糖、1 mmol/L苯酚、1 mmol/L胆酸钠、0.5%甘油、10 mg胆固醇、1 mg苯并芘、1 mmol/L苯甲酸、1%辛烷（V/V）和1%环己烷（V/V）的最适培养基中，根据浑浊度变化判断细菌是否具有代谢能力。

3 结果和分析

Thau-01为细小杆状，革兰氏阴性细菌。培养基最适pH为8，最适培养温度为30℃，最佳底物浓度为4～8 mg/mL。在最适条件下底物浓度为8 mg/ml时细菌代时为56min。该细菌在反硝化条件下不能代谢甘油、果糖、乳糖、棉子糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、乳糖、苯酚、苯甲酸、胆酸钠和苯并芘等化合物，能代谢1%辛烷和环己烷。该细菌16s RNA编码序列的前500个碱基与Thaueraaromatica和Sterolibacteriumdenitrificans strain Chol-1S同源性最高，为94%。此外，该菌与Georgfuchsiatoluolica strain G5G6，反硝化富集物中分离的两个克隆NOA 1 F6和NOB 2 A10有92%的同源性。其中Strain Chol-1S是由澳大利亚的一个实验室分离到的，该细菌为革兰氏阴性细菌，短棒状，细菌的一端有鞭毛一根，可运动，菌体上附着有纤毛，除固醇类化合物，该细菌仅可以代谢长链饱和脂肪酸[7]。T.aromatica是一类能够在有氧和反硝化条件下降解代谢芳香类化合物的细菌，不善于利用糖类和固醇类化合物。Strain G5G6是2009年由荷兰的实验室在甲苯为底物、多种电子受体存在的厌氧条件下分离到的，该菌分别以三价铁、硝酸为电子受体、以甲苯为底物生长，虽然也代谢固醇类化合物，却不利用胆固醇[10]。将Thau-01与上述三个属的细菌进行对比，认为Thau-01与Sterolibacteriumdenitrificans更相似，当然这一推测还需要经过进一步验证。

[1]王雪艳.粪甾醇作为海岸排污口检测指标的研究[D].大连:大连海事大学,2007.

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