小鼠骨髓和睾丸细胞在细胞生物学实验染色体制备中的应用比较

2018-03-28黄伟伟李绍军高梅张斌

生物化工 2018年3期

黄伟伟，李绍军，高梅，张斌

（西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨凌 712100）

染色质是细胞遗传密码的物质载体，也是细胞代谢和遗传活动的调控基础。染色体制备技术是细胞生物学及遗传学的核心基础技术之一，综合院校的细胞生物学实验课程大都包含染色体制备实验。然而染色体制备技术复杂，操作环节多，耗时长，影响因素多，在实际实施过程中获得理想染色体的成功率很低，因此需要进一步改进优化，提高成功率，使学生能够真正掌握染色体标本的制备技术，了解染色体的数目以及形态特征[1]。染色体只出现在分裂期的细胞中，以分裂中期的染色体结构最为典型，因此要想获得理想的染色体标本，前提是获得足够的分裂中期细胞。目前，运用最广泛的方法是体外培养外周血细胞，利用植物凝集素（PHA）刺激淋巴细胞进入有丝分裂，培养72 h后，再用秋水仙素处理使细胞周期停滞在分裂中期，再经低渗、固定、滴片等处理，获得可用染色体标本。外周血培养法虽然能够获得大量的分裂中期细胞，然而需要进行细胞无菌培养，而且实验耗时较长、风险较大，不便于在教学实验中开展。动物机体内的骨髓和睾丸细胞分裂比较旺盛，所以小鼠骨髓或睾丸是实验教学中制备染色体较为理想的实验材料。本文比较了利用小鼠骨髓和睾丸细胞制备染色体的优劣，并讨论了染色体制备过程中的注意事项和改进方法。

1 秋水仙素处理

为获得较多的分裂中期细胞，通常利用秋水仙素能够结合微管并阻止微管组装的特性，实验前给实验小鼠注射一定量的秋水仙素，促使骨髓和睾丸中的分裂细胞停滞在分裂中期。实验小鼠一般选择2～3月龄达到体成熟的昆白鼠，秋水仙素配制为1 mg/mL溶液，一般按照4～6μg/g BW的剂量进行腹腔注射，3～4 h后采用脱臼法处死小鼠，分离细胞。

2 细胞分离

2.1 骨髓细胞分离

剪开小鼠腹部和后腿皮肤，从髋关节处切开，分离后腿，剥离股骨和胫骨上的肌肉组织，取得完整股骨和胫骨，切去两端，暴露骨腔；用1 mL注射器吸取2%柠檬酸钠溶液，通过针头将溶液注入骨腔中，将骨髓细胞冲至10 mL离心管中，反复冲洗骨腔，直至骨髓腔由粉红变为白色，以尽可能多地分离获得骨髓细胞；摘掉针头，用注射器轻轻反复吸打细胞悬液，将细胞团块分散为单个细胞。

2.2 睾丸细胞分离

剪开小鼠腹部，暴露腹腔，沿着输精管查找小鼠睾丸；剪下睾丸，转移至小烧杯中，剪碎；加入3 mL 2%柠檬酸钠溶液，用玻璃棒进一步捣碎；再用胶头滴管反复吹打均匀，用镊子挑出大的组织团块；用注射器取1 mL细胞悬液转移至10 mL离心管中。

3 染色体制备

3.1 低渗处理

向离心管中加入8 mL预热的0.4% KCl溶液（0.075 mol/L），在37℃水浴锅中低渗处理30 min。

3.2 预固定

向离心管中滴加新配制的甲醇-冰醋酸固定液1mL，用吸管轻轻吹打1～2 min混匀，1 000 r/min离心8 min，弃去上清。

3.3 固定

加入5 mL新配制的固定液，用吸管轻轻吹打混匀，室温静置10 min。1 000 r/min离心8 min，弃去上清。重复固定2～3次。

3.4 滴片

固定好的细胞经离心后，吸去上清，视细胞量残留0.5～1 mL固定液，轻轻吸打形成单细胞悬液。取出干净并预冷的载玻片，以一定垂直高度滴加细胞悬液，风干或者酒精灯烘干。

3.5 染色

将滴加有细胞的载玻片细胞面朝上水平放置，滴加1∶10 Giemsa染液3～4 mL，染色10 min，流水冲洗掉染液，干燥后镜检。

4 结果观察

低倍镜下观察细胞分散转态和细胞分布，选择形态清晰、分散良好、背景干净的中期分裂相染色体，用油镜细致观察。理想的中期分裂相染色体形态应为染色体集中分布，每条染色体结构清晰，长度适中，形态一般程“U”形，着丝粒位置清楚，数目为2n=40，染色效果好，无染色体缠绕，重叠现象。

5 骨髓和睾丸细胞制备染色体优劣比较

5.1 骨髓细胞

骨髓细胞是机体中分裂比较活跃的细胞，是制备染色体标本较好的细胞来源。利用骨髓细胞制备染色体标本，可以观察有丝分裂中期体细胞染色体的形态结构。然而，为获得骨髓细胞，需要对小鼠进行深度解剖，如果学生缺乏解剖学知识，在分离股骨和胫骨过程中会耗费大量时间；而且在解剖过程中由于气味和出血，会使学生尤其是女生产生厌恶心理而不愿意动手；此外，解剖操作不熟练往往导致分离的股骨不完整，致使冲洗得到的骨髓细胞数量较少，由于中期分裂相比例很小，进而导致染色体制备成功率低，制片后观察耗费时间长，找到中期分裂相染色体比较困难。

5.2 睾丸细胞

在雄性小鼠性成熟后，睾丸中的精母细胞不断分裂分化，也是制备染色体标本较好的细胞来源，可以观察减数分裂不同阶段生殖细胞染色体的形态结构。睾丸的解剖分离相对比较容易；此外，睾丸体积较大，破碎后会得到细胞数量相对较多，因此利用睾丸细胞制备染色体的成功率相对较高。但实验过程中只是通过机械剪切的方式破碎睾丸，细胞的分离往往不够彻底，残留的组织团块较多，会对后续的染色体制备和观察产生负面影响，因此，在睾丸破碎后最好用细胞筛网进行过滤，甚至可以利用擦镜纸进行过滤，以除去残留的组织块。

通过比较骨髓细胞和睾丸细胞制备染色体的优劣，发现睾丸细胞更有优势，其操作简单，耗时较短，细胞数目多，成功率高。然而，在实际实验教学中，可以同时利用骨髓细胞和睾丸细胞进行染色体的制备，一方面可以充实实验内容，提高实验趣味性；另一方面还可以让学生比较两种细胞的染色体的差异，加深学生对有丝分裂和减数分裂的认识。

6 染色体制备方法改进和注意事项

在实际教学实验中，学生制备的染色体标本结果通常是成功率很低，镜检看到的是数目较多的间期细胞，中期分裂相很少，染色体分散性差，形态结构不典型[1]。因此，除了选择合适的细胞材料，还需要做好以下几个关键环节的处理，才能得到理想的中期染色体。

6.1 分裂中期细胞获取

中期分裂相细胞的数量和质量是成功制备染色体的基础。中期分裂相细胞的数量和质量可以从3个方面进行控制：（1）小鼠质量，一般应选择2～3月龄体成熟的雄性昆白鼠，体重应在25～35 g；（2）刺激骨髓细胞分裂，可以预先24 h采取腹腔注射淀粉汤，剪掉一小块皮肤，甚至人为制造炎症和刺激造血，以促进骨髓细胞分裂增殖[2]；（3）分裂中期细胞阻滞，通常通过腹腔注射秋水仙素以引起骨髓细胞和睾丸细胞周期停滞在分裂中期，关键在于秋水仙素的注射剂量和处理时间。通常采用4 μg/g BW的剂量提前处理3～4 h来阻断骨髓细胞分裂，而对于睾丸细胞，有研究证实提前6 h注射6 μg/g BW的秋水仙素效果较好。

6.2 低渗处理

低渗的目的是通过吸水膨胀，增大细胞体积，充分分散染色体，防止染色体缠绕。低渗处理的适当与否决定了染色体的分散程度，低渗不充分，染色体分散不彻底，低渗过度，容易造成细胞破裂。低渗一般使用0.4%KCl溶液，在37 ℃水浴锅中低渗处理30 min，溶液需要提前预热，增强处理效果。同时低渗溶液的用量尽可能多，以保证低渗效果。笔者的实验经验是一般细胞悬液体积控制在1 mL左右，低渗溶液可以添加8 mL。

6.3 固定

固定的目的是稳定染色体结构。通常需要进行固定，首先是预固定，在低渗处理结束后，直接加入1 mL甲醇-冰醋酸固定液，混匀1～2 min，以防止细胞结块，离心后再用固定液重复固定2～3次，每次10 min，以保持染色体形态。固定液一定要新鲜配制。由于固定液中的甲醇易挥发、毒性大，可用乙醇替代，效果一致[3]。

6.4 滴片

通过滴片可以破碎细胞，使染色体分散附着在载玻片上，便于后续的染色，显带等核型分析。因此，滴片也是染色体制备的关键环节之一。要做好滴片，首先要提前准备好载玻片，载玻片必须清洁干净，不含油脂杂质，至少提前4 h冷冻，通过低温促使液滴扩散，使细胞牢固的附着在载玻片上，同时通过冻融促进细胞破裂。其次控制好细胞浓度，由于获得的骨髓细胞较少，操作环节中可能还有部分细胞丢失，滴片时的细胞数量一般不是很多，因此在固定离心后，尽量保留较少的固定液，一般只保留0.5～1 mL，以提高细胞密度。最后滴片时要控制好高度，高度太低细胞分散不够，染色体容易重叠，高度过高增加操作难度，造成细胞损失，导致染色体过于分散，断裂，丢失。根据笔者的经验，0.8～1.0 cm的高度就能够保证液滴扩散良好，染色体分散均匀。如果细胞数量太少，可以提前在载玻片背面画圈，滴片时将细胞滴在圈内，能够增加圈内的细胞数量，便于镜检观察。