microRNA的分析检测方法的研究进展

吴筱原，彭书传

（合肥工业大学资源与环境工程学院，安徽合肥 230009）

microRNA是真核生物体内一类短小、内源性、无编码的单链RNA分子，通常由18～22个核苷酸组成[1]。在细胞进化的过程中，microRNA高度保守，是转录后基因表达的调控因子，在细胞的增殖、分化、凋亡、脂类代谢等过程中发挥着重要作用[2]。临床研究表明，microRNA的异常表达与很多疾病都密切相关，如癌症、神经性病症以及糖尿病等[3-5]。因此实现对microRNA的高精度高灵敏度检测在科研领域以及临床试验都十分必要。由于microRNA本身十分短小、序列之间的高度同源性，检测microRNA面临诸多挑战[6]。

近年来，为了实现对microRNA的定量检测，研究人员建立了多种灵敏度高、特异性强、高通量的检测方法。本文结合目前microRNA的检测方法进行详细的阐述和分析，为今后开展microRNA的研究提供参考。

1 microRNA早期检测方法

1.1 Northern blotting

Northern blotting法是建立在固相杂交基础上定量检测microRNA的方法[7]。该法原理是将DNA探针和硝酸纤维素膜上的microRNA进行杂交，洗膜显影后根据条带进行分析。该法缺陷在于操作过程繁琐，无法实现高通量，在实验过程中易造成环境危害。此外，该法的灵敏度和特异性较差且耗时耗量。

1.2 微阵列法

微阵列技术是基于杂交原理检测microRNA的方法，能够同时检测多个样品，高通量分析。该法通过荧光标记的microRNA与固定在芯片上的DNA探针杂交，经荧光扫描获取信号强度并结合相应的软件进行microRNA的表达分析[8]。但微阵列法常伴有假阳性结果，重复性差、灵敏度较低，且芯片的制作和检测费用高。

1.3 定量-逆转录PCR法

定量-逆转录PCR法是检测较低水平microRNA的有力工具[9]，该法的原理是将microRNA反转录成相应的cDNA，再以cDNA为模板进行扩增，通过实时检测扩增产物的数量，实现对microRNA的定量分析。此法会引入pri-microRNA或pre-microRNA，导致无法精确定量，检测成本较高。

2 microRNA检测新方法

由于microRNA传统检测方法存在操作复杂、浪费样品、灵敏度特异性差等弊端，促使研究者在原先的基础上发展出更多新的方法满足科研领域和临床试验的需求。

2.1 滚环扩增法

滚环扩增法（RCA）是一种等温扩增技术，引物和环状ssDNA结合之后，在DNA聚合酶的作用下，实现DNA的连续扩增产生大量同序列的线性单链DNA，结合相应的DNA检测技术即可间接地检测microRNA[10]。RCA包括直接滚环扩增和锁探针-滚环扩增，该法操作简便，无需特殊装置，但由于扩增的时间较长，模板的合成难度较大、成本高，使用率并不高[3]。

2.2 基于指数扩增的检测方法

指数扩增反应（EXPAR）是一种等温扩增技术，能够在短时间将十几个碱基的核苷酸在恒温条件下扩增106倍以上[11]。模板的两端序列都与靶分子互补配对，中间夹杂一段被切口酶识别序列的互补序列。靶向microRNA退火并与模板的3’端杂交后，在DNA聚合酶的作用下延伸形成含有靶向microRNA的杂化物，并在切口酶作用下释放大量单链DNA，该ssDNA与靶向microRNA序列完全相同，作为引物触发新的EXPAR，如此循环完成指数扩增。该法检测速度快、特异性好，已被越来越多地应用到研究领域，但由于模板单一、无法实现高通量检测，研究者们又不断提出改进措施。

2.3 酶辅助检测microRNA

在普通的探针杂交法检测microRNA的过程中，由于缺少信号放大过程，检测强度一般较弱、灵敏度较低。酶辅助的检测方法通过工具酶的辅助能够将得到的检测信号进一步放大或扩增，提高检测的灵敏度。该法首先根据靶分子的序列人工合成一段特异性探针，让探针与靶分子混合形成杂化体结构，借助切口酶剪切探针产生检测信号，同时释放出靶分子，循环反复实现EXPAR，放大检测信号。由于该法操作简便条件温和，已被逐步应用于microRNA的定量检测中。但同时探针设计的难度较大，模板退火会造成假阳性结果。

2.4 基于纳米技术的microRNA检测法

纳米金颗粒因其具有较高的电子密度、优良的介电特性以及高效的催化作用等优点被广泛用作检测microRNA的载体。纳米金比色法检测microRNA的原理是基于它在分散状态下呈红色，团聚后呈蓝色。在没有目标microRNA存在的情况下，纳米金通过DNA探针交联形成网状结构，呈现出红色；当目标microRNA存在时，DNA探针能够识别并结合目标microRNA，形成双链结构，此双链结构中的DNA随后被DSN特异性识别并切割，释放microRNA和纳米金，溶液变紫色。在DSN酶作用下引发扩增循环，检测信号得到放大，此法的检测限可达到10-16mol/L[12]。

虽然基于纳米技术的检测方法灵敏度高、特异性好、能够实现高通量检测，但是由于纳米颗粒本身易团聚，受溶液状态影响较大，如pH、离子浓度，纳米颗粒表面附着的探针数量也会影响其检测结果。

2.5 测序法

对于未知序列的microRNA的检测通常需要借助测序法，如克隆测序、新一代高通量测序、Nano String读数等，这些技术可用于分析特殊样品中microRNA的种类，样品经扩增后再测序，根据microRNA的表达谱对其定量[13]。

新一代大规模测序技术主要有罗氏公司的454焦磷酸测序技术、Illumina公司的Solexa基因组测序[14]。这两种技术均可实现对microRNA的定量检测，而且能够检测已知microRNA的长度和序列的变化以及表达程度。这两种方法的步骤相近，即准备样品后制备模板继而测序将得到的结果进行比对[15]。虽然新一代测序技术能够实现对微量样品中microRNA的高通量检测，但由于对仪器设备有较高的要求，未能被广泛应用到实际当中。

2.6 纳米孔单通道技术检测microRNA

纳米孔单通道技术是根据电流脉冲信号对待测物进行检测的电化学传感技术。近几年来，通过纳米孔检测microRNA的方法也被广泛应用。目前，多数纳米孔检测方法都是基于构建microRNA-DNA杂化体的形式来直接检测microRNA，纳米孔的直径一般只允许单链DNA或microRNA穿过，在形成杂化体后，其穿越纳米孔的阻滞时间和电流幅值发生改变，据此实现检测目的。该法能够达到较低的检测限，抗干扰性好，但较之于PCR扩增，存在低通量的缺陷导致不能被广泛的应用于临床研究。

3 总结与展望

microRNA在细胞的增殖、发育和凋亡等一系列过程中起着关键作用，其异常表达与多种疾病密切相关。因此，microRNA可作为癌症诊断和预测的生物标志物，也可作为新药物潜在的作用对象。实现对microRNA的定量检测对于多种疾病的前期诊断以及新药物开发都具有重要的意义，microRNA的定量检测方法主要集中在各种探针设计和标记技术，结合微阵列芯片、实时荧光定量PCR、滚环扩增、指数扩增、酶辅助、高通量测序和纳米孔单通道技术等联用来实现高灵敏度和特异性检测。随着新技术的发展，新一代测序技术的普及，microRNA的检测技术会更广泛地应用在科研领域及临床试验中。

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