植物黄酮醇生物合成关键基因研究进展

方 芳,王凤忠

(中国农业科学院农产品加工研究所,北京 100193)

黄酮醇是广泛存在于植物体内的一类重要的次生代谢产物和类黄酮化合物[1],其不仅具有抗氧化[2]、抗癌[3]、抗炎[4]等多种重要的生理功能,同时与植物的生长发育及色泽等外观品质的形成密切相关[5-6],因此，黄酮醇作为对植物营养及外观品质形成具有决定作用的一类重要的次生代谢产物，近年来在植物及食品等研究领域备受关注。

黄酮醇的生物合成是由苯丙烷类代谢途径和类黄酮代谢途径共同决定的,生物合成过程中需要苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)、肉桂酸-4-羟化酶(Cinnamate 4-hydroxylase,C4H)、4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate CoA ligase,4CL)、查尔酮合成酶(Chalcone synthase,CHS)、黄酮醇合成酶(flavonol synthase,FLS)等多个酶的共同作用与参与[7-8]。大量研究表明,PAL,C4H,4CL,CHS,FLS等基因的表达易受温度[9-10]、光照[11-12]、水分[13]、盐胁迫[14]或病原菌[15]等多种外源环境因素的作用从而影响植物黄酮醇的积累,因此，了解植物黄酮醇生物合成关键基因的研究进展对于有效调控植物黄酮醇的生物合成具有重要意义。本文综述了植物黄酮醇生物合成关键基因的克隆、分布、特性及其对外源环境条件应答的最新研究进展,以期为植物黄酮醇的积累及调控提供参考依据。

1 相关基因研究进展

1.1 PAL基因

PAL是连接初生代谢和次生代谢的关键酶,也是苯丙烷类代谢途径的第一个酶和限速酶[12,16]。其不仅是决定高等植物中多种次生代谢产物生物合成的关键酶[12,17-18],同时与植物生长发育[18-19]、外观与营养品质形成[18,20]及对逆境胁迫的抗性[14-15,17]等的形成密切相关。PAL基因是由Koukol等[21]在1961年首次从大麦中发现并提取的,之后有关PAL基因的克隆及其表达特性的研究迅速展开[22]。目前有关PAL基因克隆的研究多集中于被子植物中[15],其基因全长或片段已在拟南芥[23]、大豆[24]、小麦[25]、洋葱[19]、芒果[26]、蓝莓[27]等多种粮食及经济作物中得到克隆。由于PAL与植物木质化及木质素的生物合成密切相关,因此有关PAL基因的克隆与表达研究在木质素依赖及易木质化植物中备受关注。刘佳等为研究南瓜种皮木质素合成机理,对有壳南瓜(Cucurbitapepo)种皮的PAL基因(CP-PAL)进行克隆并获得全长1720 bp,开放阅读框1359 bp,可编码452个氨基酸的基因序列。实时荧光定量PCR分析发现在种皮发育过程中,PAL基因在裸仁南瓜中的表达量显著低于其在有壳南瓜中的表达量,推测CP-PAL基因可能通过参与调控种皮木质素的合成来影响美洲南瓜裸粒品种的种皮发育[22]。李丹青等[28]为研究杏鲍菇贮藏过程中的木质化机理,对其木质化关键酶基因进行克隆及表达分析,从杏鲍菇中克隆得到序列全长为2441 bp、完整开放阅读框为2229 bp、可编码743个氨基酸的PAL基因(PePal),荧光定量PCR分析发现,在各贮藏温度下,PePal基因表达水平与PAL活性及木质素含量变化趋势一致,推测PePal基因的表达可能受温度等环境因素诱导,在低温贮藏条件下对杏鲍菇木质化发挥重要作用。

除基因的克隆研究外,由于PAL基因的表达水平与多酚及黄酮类化合物的积累密切相关[23,29],近年来有关其体内分布、特性、在植物生长发育及抵御逆境胁迫中的作用等方面的研究也备受关注[22]。Li等[12]从香鳞毛蕨(Dryopterisfragrans)中获得了3个PAL基因片段(DfPAL1,DfPAL2,DfPAL3),发现DfPAL3在香鳞毛蕨的配子体及叶柄中大量表达,DfPAL1在叶柄中大量表达,而DfPAL2在叶子及叶柄中的表达量均较低,但其可受温度及紫外线诱导。Ban等[18]对西洋梨(Pyruscommunis)中的PAL基因(PcPAL)进行克隆并对其在不同西洋梨品种和不同组织部位的表达模式进行分析,发现PcPAL基因的表达与品种、果实的发育阶段和组织部位具有相关性,在西洋梨成熟后期,不同品种间的PcPAL基因的表达模式存在明显差异,PcPAL基因的表达对Red Bartlett品种果肉的花色苷积累无影响,但与Red d’Anjou品种的花色苷积累密切相关。Yang等[16]对红橘(CitrusreticulateBlanco)中的PAL基因(CrPAL1)进行克隆,经亚细胞定位发现其主要分布于质膜上,且其基因表达量在铁离子胁迫下显著升高。Mrázová等以豆科模式植物百脉根(Lotusjaponicas)为对象,研究盐胁迫对其不同组织中PAL基因表达的影响,发现盐胁迫会导致植物根部及叶片中的PAL基因表达发生显著变化[14]。Zhang等[15]在研究大豆(Glycinemax(L.)Merr.)PAL基因对疫霉菌(Phytophthorasojae)的应答机制时发现,大豆疫霉菌对GmPAL2.1基因具有诱导作用,GmPAL2.1基因反之可显著提高转基因大豆作物对大豆疫霉菌的抗性。

1.2 C4H基因

C4H是苯丙烷类代谢途径的第二个关键酶[12,30]。作为细胞色素P450加氧酶家族CYP73亚家族中的一员,其可催化香豆酸转化为反式肉桂酸,参与包括类黄酮及木质素等多种植物次生代谢产物的生物合成[30-31],并与植物抵御逆境胁迫的抗性形成密切相关[13]。C4H基因是在1967年首次从豌豆苗的顶芽中发现的[32],之后有关C4H基因的研究迅速展开[22]。尽管P450加氧酶的不稳定性及其膜结合特性给C4H基因的分离带来较大困难[30],但目前其基因全长或片段已在棉花[33]、烟草[34]、青稞[35]、紫茎泽兰[36]、砀山酥梨[37]等多种植物中得到克隆和表达。

关于植物C4H基因的研究，除对不同物种中的相关基因进行克隆与表达研究外,有关其在植物体内的分布、特性、与植物生长发育的关系及其对逆境胁迫的应答反应等研究也在稳步推进。程俊等[37]在对砀山酥梨果实C4H基因进行克隆的同时对其表达特性进行分析,发现PbC4H基因在果实发育过程中表达量呈现先升高后降低的趋势。Xia等[31]对野茶树(Camelliasinensis)中的三个C4H基因(CsC4Ha,CsC4Hb及CsC4Hc)分别进行克隆与识别,发现CsC4Ha在茶树第四叶片高度表达,CsC4Hb在嫩叶中高度表达,而CsC4Hc则在嫩茎中高度表达,推测3个CsC4H基因在植物体内可能分别具有不同的亚细胞定位和生理功能。赵乐等[13]对独行菜(Lepidiumapetalum)C4H基因进行克隆,发现LaC4H基因的表达量在茎中最高,其次为叶、花和根,茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)对叶中LaC4H基因表达具有诱导作用,且其表达量与黄酮含量呈现明显正相关[38]。Abdollahi等[13]在研究干旱胁迫对罗勒苯丙烷类代谢途径中关键基因的影响时发现,在田间含水量为50%时,C4H基因的表达量明显降低。有关C4H基因的研究报道除在被子植物中进行外,近年来在蕨类植物及苔藓类植物中也在开展探索性研究并取得一定研究进展[12,30]。Li等[12]从香鳞毛蕨(Dryopterisfragrans)中获得了C4H基因片段(DfC4H),发现DfC4H在香鳞毛蕨的配子体及叶柄中高达表达,同时可受4、35 ℃及紫外照射的诱导。Liu等[30]根据现有地钱植物转录组序列信息对苔藓植物中3个C4H基因PaC4H、MpC4H1和MpC4H2进行克隆和功能特性分析,发现PaC4H基因可受水杨酸或UV辐射等非生物胁迫条件的诱导而大量表达。由此可见,C4H作为苯丙烷类代谢途径的第二个关键酶,其相关基因的表达不仅与植物的组织部位、生长发育阶段等密切相关,同时受温度、光照、水分及植物激素等多种外源环境因素的诱导,并与植物木质素及类黄酮等次生代谢产物的生物合成密切相关。

1.3 4CL基因

4CL是苯丙烷类代谢途径中除PAL和C4H外又一关键限速酶,同时也是连接苯丙烷代谢途径和木质素生物合成途径的关键酶,其可将羟基肉桂酸转化为羟基肉酰-CoA酯,在参与木质素生物合成的同时,还对类黄酮等次生代谢产物的生物合成产生重要影响[39]。4CL基因是在1987年首次从欧芹中发现并克隆的[40],之后有关4CL基因的研究在不同植物中迅速展开[41]。目前4CL的基因全长或片段已在拟南芥[42]、银杏[43]、葛根[44]、沙漠白杨[45]、白花前胡[41]等多种食用及药用植物中得到克隆。与此同时,由于前期有关4CL基因的克隆和表达多在裸子植物及被子植物中开展[46],近年来在蕨类植物及苔藓植物中也出现了有关4CL基因克隆的相关报导。Li等[47]从香鳞毛蕨(Dryopterisfragrans)中克隆了4CL基因Df4CL,并对其表达模式进行分析和预测,为蕨类植物次生代谢产物的积累及调控研究提供了理论基础。Gao等[46]从苔类植物钝鳞紫背苔(Plagiochasmaappendiculatum)中克隆得到全长为1644 bp,可编码547个氨基酸的4CL基因Pa4CL,并发现水杨酸或茉莉酮酸甲酯对其转录行为具有诱导作用。

因4CL基因的表达与植物类黄酮及木质素的生物合成密切相关,而植物类黄酮和木质素又是决定植物及植物源食品营养及外观品质的重要因素,因此研究4CL基因在植物中的分布、表达特性、在植物生长发育过程中的变化及其对外源环境因素的应答等，对于有效保持或改善植物及植物源食品的品质具有重要意义,近年来相关研究也备受关注。裴艳梅等[39]从无核小枣果实中克隆得到4CL基因Zj4CL。经实时荧光定量PCR分析发现,Zj4CL基因的表达与果实发育时间密切相关。董丽丽等[48]对红玉石籽石榴(Punicagranatumcv. Hongyushizi)的4CL基因进行克隆,获得4CL同源基因Pg4CL,发现Pg4CL基因在不同石榴品种中的表达量存在显著差异,在石榴叶片和果皮中的表达量较高,种皮中的表达量最低,而在石榴籽粒发育过程中,表达量呈现先升高后降低的趋势。Zhang等[45]从沙漠白杨和盐敏感型白杨品种中共识别到20个4CL基因,经转录谱分析发现,盐胁迫条件下沙漠白杨品种中的4CL1,4CL11和4CL12三个基因的表达与盐敏感型品种间存在显著差别,推测沙漠白杨的抗盐性与4CL基因的进化有关。Li等[9]在研究苯丙烷代谢途径关键基因对枇杷(Eriobotryajaponica)果肉木质化的影响时发现,Ej4CL基因是导致枇杷果肉木质化的关键基因,同时Ej4CL基因对低温反应十分敏感,可被热处理或低温条件抑制。由此可见4CL基因的表达与植物品种、组织部位及生长发育阶段等多种因素密切相关,同时可受温度及盐分等多种环境因素的影响,选择合适的环境条件对植物4CL基因进行调控对于保持或提高植物品质具有重要作用。

1.4 CHS基因

CHS作为植物聚酮合酶家族中的一员,是植物类黄酮化合物生物合成途径的第1个关键酶[49-50]。其可将1分子4-香豆酰辅酶A与3分子丙二酰辅酶A催化生成黄酮类物质的骨架结构-查尔酮,并进一步衍生出不同种类的类黄酮化合物[51]。CHS基因是在1983年首次从欧芹中发现并分离的[52],因其与植物类黄酮化合物的生物合成密切相关[53],同时在植物的花粉育性、UV防护及抗病性等方面发挥重要作用[54-55],其后有关其基因的研究迅速展开。目前CHS基因已在白菜类蔬菜[55]、花椰菜[54]、山葡萄[56]、桂花树[53]、姜黄[51]等多种植物中得到克隆,在Genebank数据库中有关植物CHS核苷酸序列的记载已有超过4000条[57]。

鉴于CHS基因与花色苷、黄酮醇等多种与植物外观和营养品质相关的植物类黄酮化合物的生物合成密切相关[53],有关其表达特性及与逆境胁迫的关系研究近年来也备受关注。Ma等[53]从桂花树(Osmanthusfragrans)中克隆得到CHS基因OfCHS,发现OfCHS基因在叶中的表达量明显高于花瓣。Cao等[50]从水蕨(Ceratopteristhalictroides)中克隆得到CHS基因CtCHS,发现CtCHS基因表达可受UV辐射的诱导。Wei等[10]在研究热空气处理对樱桃番茄果实的苯丙烷类代谢产物积累及其生物合成相关基因的表达量的影响时发现,热空气处理在促进黄酮醇等类黄酮代谢产物积累的同时,可显著提高其LeCHS基因的表达及其对病原菌的抗性,推测热空气处理可通过提高代谢途径上生物合成关键基因的表达量提高下游代谢产物的积累,进而促进果实抗病性的提高。由此可见,CHS作为类黄酮代谢途径上的第一个关键酶,其不仅决定着下游多种类黄酮代谢产物的生物合成,同时其表达模式与植物种类、组织部位及植物的发育阶段等密切相关,并受光照、温度等多种外源因素的影响。通过选择合适的外源环境因素对其表达模式进行诱导或调节,可对下游次生代谢产物的生物合成进行有效调控。

1.5 FLS基因

FLS为2-酮戊二酸铁依赖酶家族中的一员,其可将二氢黄酮醇转化为黄酮醇[58],是决定黄酮醇类物质生物合成反应最后一步的关键限速酶[59]。FLS基因是1993年首次从矮牵牛中发现并克隆的[60],其后在苦荞[61]、银杏[58]、黄芩[62]、枸杞[63]、观赏海棠[64]、黄花苜蓿[65]等多种植物中均有关于FLS基因克隆的报道。目前,在Genebank中有关FLS核苷酸序列的记载已有100余条[57]。

作为植物黄酮醇生物合成的关键限速酶,FLS基因的表达与调控对黄酮醇类化合物的生物合成至关重要,因此近年来有关FLS基因的分布和表达特性,及外源环境条件对其诱导和调控的研究逐渐成为研究热点。杨文婷等[59]根据红花转录组中获得的序列,采用RT-PCR法对红花FLS基因进行克隆,获得了长度为224 bp的基因片段,经比对发现该基因与其他物种的FLS基因具有较高同源性，并通过对红花不同品种不同花期样品进行荧光定量PCR分析发现,红花FLS基因在吉红油姊妹系的盛花期表达量最高。Xu等[58]对银杏中的FLS基因进行克隆,获得具有1023 bp开放阅读框可编码340个氨基酸的全长基因GbFLS,发现GbFLS在银杏根、茎、叶和果实中均有表达,且其表达量受UV-B、脱落酸、低温、蔗糖、水杨酸及乙烯利等多种非生物胁迫条件的诱导。Liu等[11]在研究UV-B对长相思葡萄类黄酮生物合成的影响时,以5个FLS基因(VvFLS1-5)为对象研究UV-B对其表达模式的影响,发现长相思葡萄中VvFLS4和VvFLS5基因具有转录活性,并受UV-B辐射的诱导。Zhang等[66]在研究外源环境条件对长叶红沙(Reaumuriatrigyna)黄酮醇类化合物积累的影响时发现,NaCl和UV-B处理可显著提高RtFLS1和RtFLS2基因的表达量,同时伴随有芦丁、杨梅酮等黄酮醇类物质含量的显著增加,推测NaCl和UV-B处理对长叶红沙黄酮醇类物质积累的促进作用可能是通过调节FLS等类黄酮代谢途径相关基因的表达实现的。由此可见,FLS基因作为黄酮醇生物合成途径上的最后一个关键基因,其不仅直接决定黄酮醇类物质的生物合成,直接参与二氢黄酮醇向黄酮醇类物质的转化,同时其表达模式和表达量还与植物的生长发育时期及盐分、紫外线及水杨酸等多种植物生长调节剂的作用密切相关,因此明确FLS基因对外源环境条件的应答反应及机制对于更好地调控黄酮醇类物质的生物合成至关重要。

2 问题与展望

黄酮醇作为与植物色泽、口感和风味形成密切相关的次生代谢产物,同时作为与人体健康密切相关的功能活性因子,是决定植物及植物源食品营养及外观品质的重要类黄酮化合物。因此推进植物黄酮醇类化合物生物合成关键基因的研究,对于有效促进植物黄酮醇类化合物的积累及调控,有效提高植物及植物源食品的品质具有重要意义。虽然目前有关苯丙烷类代谢途径及类黄酮代谢途径的研究较多,其相关生物合成关键基因的研究也备受关注,但大部分研究均侧重于木质素或花色苷生物合成的研究,而黄酮醇生物合成作为类黄酮生物合成途径的重要分支,目前有关其关键基因的研究尚处于起步阶段,有关其关键基因对黄酮醇类物质积累的影响及外源环境条件对其关键基因的调控作用及机制研究更少,从而极大限制了植物及植物源食品品质的提升。

针对上述问题,后续研究中,应注意打破过分关注花色苷类化合物生物合成的研究格局,而应加强黄酮醇等辅色物质生物合成的研究。而在植物黄酮醇的研究中,应注意打破过分强调植物黄酮醇类物质检测分析的研究现状,而应将化合物检测分析研究与代谢途径和关键基因表达分析研究有机结合,并注重加强外源环境条件与其生物合成关键基因表达关系的研究,从而从根本上解决植物黄酮醇积累及代谢调控的有关问题,为植物及植物源食品品质提升奠定基础。