益生菌胞外蛋白与肠道粘膜免疫细胞互作关系的研究进展

臧凯丽,任效东,王秋萍,王 泳,阎亚丽,赵 培,赵林森,刘爱国,*,陈庆森,*

(1.天津市食品生物技术重点实验室,天津商业大学生物技术与食品科学学院,天津 300134;2.河北一然生物科技有限公司,河北石家庄 050800)

肠道是消化吸收的重要场所,也是人体最大的免疫器官。肠粘膜作为一个巨大的外环境表面,是机体与环境进行各种信息交流的重要场所。益生菌最初主要是有选择性地被应用于食物的加工处理过程中,随着微生态学的发展,应用的范围逐渐拓宽,益生菌及其制剂已作为活菌膳食补充剂用于促进机体健康发展[1]。益生菌(Probiotics)是一类对宿主有益的活性微生物,定植于人体肠道、生殖系统内,能产生确切的有益健康的功效从而改善宿主微生态平衡[2]。研究报道已经发现了30多种疾病与肠内微生态系统有关,使用人体无害的益生菌治疗一些肠道疾病(如粪菌移植技术)和疑难杂症(诸如癌症、糖尿病、肥胖症、过敏等)均与肠内细菌有关[3-6]。众多科学研究精准地指向,对肠道菌群的研究和深度解析是解决人类健康问题的一条可行途径。益生菌分泌的胞外蛋白是一类具有增强粘膜屏障、免疫调节、维持肠道稳态功能的蛋白质,研究表明,胞外蛋白在益生菌与肠上皮细胞之间的相互作用中起到关键作用。本文首先概括肠粘膜系统及其免疫机制和益生菌分泌胞外蛋白的作用,然后系统地介绍国内外对分泌胞外蛋白的益生菌的相关研究进展,并提出益生菌分泌的胞外蛋白在一定程度上为肠道疾病的治疗提供了一些科学解释和有价值的解决途径。

1 肠粘膜系统及其免疫机制

庞大的肠道粘膜面积构成了强大的机体粘膜免疫系统,加之在肠道中生存着的大量微生物菌群,致使外源细菌和病毒很难突破这道防线对生物体产生危害,所以人们认识到肠粘膜对健康至关重要[7]。

1.1 肠道粘膜系统

肠道粘膜是宿主防御外来有害物质对机体产生影响的重要屏障,其免疫系统由三道防线构成:第一道防线是肠道正常菌群,在整个肠粘膜免疫中起到机械屏障的作用,能够对抗进入消化道的病原微生物;第二道防线的主要成员是肠道上皮组织,通过分泌抗微生物的蛋白质或活性肽来保护肠粘膜不被损害;第三道防线中的“卫士”是肠道中的免疫系统和免疫组织[8]。

1.2 肠道粘膜免疫系统分泌粘膜因子的方式

对抗病原微生物的肠粘膜免疫可分为先天性免疫和后天获得性免疫,其先天性免疫是构成肠粘膜屏障的基础[9]。肠道中的粘膜免疫反应是由肠粘膜表面附着的抗原引发的,首先,肠道粘膜中的淋巴滤泡集结将抗原物质转移到内部的巨噬细胞中进行加工,然后,将其转移给辅助性T细胞,从而激活B淋巴细胞,使之分化增强,产生大量粘膜免疫的主要效应因子—分泌型IgA(SIgA),通过有效中和粘膜上皮内的病原体、细菌毒素和酶,削弱细菌表面疏水性,阻止病毒附着、细菌和抗原的粘附,刺激肠道粘膜表面分泌粘蛋白降解病毒,与细菌等形成免疫复合物并排出体外等作用保护机体不受外来病毒和毒素的侵害。这种方式是肠粘膜识别肠内细菌是否可以定殖在肠道内的重要方式,事实上,肠道内分泌型IgA抗体不是为了对抗肠内细菌,而是为了挑选对人类必要的细菌让它们留在肠道中。对于细菌来说,在肠道中生存并不是那么简单的事,肠道中经常会发生蠕动流,唯一不会受到蠕动流影响的是覆盖在肠壁的粘液层,这对于细菌来说,是舒适的栖身之地。但粘液层的粘性很强,普通的细菌无法进入,具有抗体吸附的细菌减少了粘液的排斥,才得以进入粘液层,所以只有IgA抗体选择的细菌才能进入粘液层[10]。

2 益生菌及胞外蛋白质分泌的研究

近些年国内外众多的学者研究报道了益生菌具有明显促进小鼠肠粘膜免疫的作用[11],能够影响早产儿机体免疫功能的成熟和发展[12],能粘附于肠粘膜并明显抑制致病菌粘附,可提高肠道微生态的稳定性[13],并且,研究发现植物乳杆菌能通过促进肠上皮细胞间紧密连接蛋白的表达来修复受损肠屏障,从而达到减轻肠道炎症的目的[14],说明益生菌在维护健康和预防疾病方面起着重要作用[15]。目前,解释并阐述国内外众多学者研究结论的分子基础,就是从益生菌分泌的对肠粘膜免疫起调节作用的代谢物质入手,其中,益生菌分泌的“胞外蛋白”就是一类重要的物质,并已经获得了一些研究成果。

就益生菌表达胞外蛋白而言,具有分泌胞外蛋白的益生菌主要有乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌等,胞外蛋白在益生菌与上皮细胞之间的相互作用中的作用不容小觑[16]。研究表明,胞外蛋白可以参与调节肠粘膜的免疫机制,包括与其他细菌的信息交流、与宿主免疫系统的交流、调节粘膜屏障功能等,通过这些机制不仅可以解释促进肠道稳态的物质基础,也揭示了益生菌保障肠道健康的科学依据。重要的是,有一些分泌胞外蛋白的益生菌已通过生物信息学手段进行了鉴定,确定了细菌的胞外蛋白可分为两类,第一类是含有信号肽的蛋白质,这种信号肽是位于序列的N-末端,直接指导输出蛋白质。第二类是与细胞表面相关的蛋白质,因细菌细胞壁的正常翻转而简单地从细菌直接脱落[17]。研究显示,在真细菌界这些分泌系统是高度保守的,在基因编码单体组分中表现高度的同源性,这些系统在革兰氏阴性细菌上表现的很明确,至少存在有七种不同的分泌系统[18]。然而,在肠道益生菌中大部分是革兰氏阳性菌,大多数蛋白的分泌均是通过一般的分泌途径(the general secretory pathway)和特殊的蛋白输出系统(the specific protein export systems)两种途径进行的[19]。第一种分泌途径是以含有一个信号肽为特征,并携带一种特殊的分选酶裂解基序(sortase cleavage motif),最著名的是Ala-X-Ala(信号肽Ⅰ型(signal peptide type Ⅰ))和 Leu-Ala-Gly-Cys(信号肽Ⅱ型(signal peptide type Ⅱ或称 lipobox 基序)[20]。原核细胞蛋白质sec分泌途径,即一般分泌途径,新合成的蛋白质作为一种前体蛋白质,并且以未折叠状态依靠 Sec蛋白质形成的亲水通道运输[21]。第二种输出系统,是以折叠/低聚体状态分泌,包括ABC转运体和双精氨酸转运系统[22]。一般认为一旦蛋白质转运到细胞表面它就会发挥其相应的功能,如粘附素(adhesins),但蛋白质如何从胞内跨越细胞质膜到细胞表面仍待研究。

益生菌的胞外蛋白可以通过覆盖肠粘膜的粘液层进行扩散,使其与上皮细胞和免疫细胞进行相互作用。在某些情况下,信号通过不同的通路传输到细胞核中,这通常要有一些激酶的参与,如丝分裂素激活蛋白激酶(MAPKs)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3K)及糖原合成激酶-3(GSK-3)等。这些共同作用会引起基因表达发生变化,细胞水平上也随之发生变化。益生菌的胞外蛋白可以调节一些信号通路和细胞应答,如不同效应分子的分泌(如趋化因子、细胞因子、还有抗菌肽(防御素))、粘蛋白的分泌、免疫功能的调节和肠道相关淋巴组织(GALT)细胞应答[23]。胞外蛋白对肠粘膜免疫机制的调节要通过可以识别胞外蛋白的受体来实现,Toll样受体(Toll-like receptor)就是其中一种,它通过将胞内信号级联识别胞外蛋白及其携带的信息传递给树突细胞,从而使树突细胞被活化而成熟,提供获得性免疫共刺激信号,从而诱导某些促炎细胞因子(IL-12,IFNγ)的产生[24],如TLR-5可以识别鞭毛蛋白[25]。另一种受体是C型凝集素受体(CLR),现已证明DC-SIGN(DC-specific ICAM-3-grabbing non-integrin)可以识别益生菌的某些胞外蛋白[26]。总之,益生菌胞外蛋白是通过肠粘膜的交互作用实现对肠粘膜免疫系统的启动,从而促进宿主肠道的健康。

3 分泌胞外蛋白的益生菌及研究的进展

3.1 分泌胞外蛋白的乳酸菌

乳酸菌是人类肠道重要的益生菌,乳酸菌能够调节肠道微生物区系的平衡,增强机体的免疫力和抵抗力,促进肠道的生长和发育,受到了学界极大关注。近些年来报道了一些乳酸菌分泌的胞外蛋白研究成果,解释了为什么会对人体肠道的稳态产生影响。

3.1.1 增强粘膜屏障和维持人类肠道稳态 Yan等[27]已研究出两种从鼠李糖乳杆菌GG(LactobacillusrhamnosusGG)上清液纯化出的蛋白质—p75和p40,它们是一类能够维持胃肠道稳态的促生长因子,能够激活蛋白激酶B,并通过PI-3K通路抑制细胞凋亡,防止肠上皮细胞YAMC(Young Adult Mouse Colon cells)的损伤,因此有预防和治疗胃肠疾病的作用。Sánchez等人[28]以鼠李糖乳杆菌GG为研究对象,对该菌所分泌的蛋白质采用SDS-PAGE进行了分离,用串联质谱(MS/MS)鉴定,发现生长在MRS肉汤的鼠李糖乳杆菌分泌的几种蛋白质,确定有一些具有预防上皮细胞屏障(细胞壁水解酶)和细菌粘附(GAPDH)损坏等特定的功能表现。Tao等[29]发现鼠李糖乳杆菌GG(LactobacillusrhamnosusGG,LGG)分泌的一种可溶性蛋白质(LGG-CM)能引起肠上皮细胞热休克蛋白(Hsp)表达增多,包括Hsp70和Hsp25。这种诱导作用持续时间很短,但上皮细胞能持续表达Hsp,并证实LGG-CM通过激活MAPKs途径而调节肠上皮细胞Hsp表达,p38和JNK的阻止剂能阻断Hsp的表达,揭示Hsp能保护肠上皮细胞免于氧应激,保持肠上皮细胞完整性。

Beck等[30]对植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)来源的细胞相关表层蛋白质的蛋白质组学进行了分析,通过SDS-PAGE电泳分析结合毛细管LC-ESI-MS/MS获得了肽序列,经数据库检索认定29种蛋白质,它们中的许多蛋白质可能涉及到益生菌在胃肠道中的作用,该结果为未来有关益生菌分子机制的研究奠定了基础。Benardo等[31]以植物乳杆菌为模型,发现植物乳杆菌分泌的一种肽STp可以诱导人类肠道树突细胞产生对炎症、自身免疫疾病的预防及肠道稳态的维持有重要作用的IL-10。因此,从应用的角度,STp可以作为添加剂或保健成分添加到食品当中,它也为IBD患者建立了非药物饮食治疗的基础。

本实验室在研究嗜酸乳杆菌CICC6005(LactobacillusacidophilusCICC6005)时发现,以固体培养获得胞外蛋白粗提液,分离L.acidophilusCICC6005胞外蛋白获得两个蛋白峰,分子量分别为67 ku和37 ku,含量分别为0.066 mg/mL和0.021 mg/mL,对HT-29细胞增殖具有不同程度的抑制作用,其中37 ku胞外蛋白的抑制作用较强[32]。研究进一步探讨了67 ku和37 ku胞外蛋白对HT-29细胞发挥抑制结肠癌细胞增殖的作用途径,结果显示,不同浓度的67 ku和37 ku胞外蛋白分别作用于HT-29细胞一定时间后,两种胞外蛋白均可以下调两个信号通路途径中p-ERK1/2、p-p38、p-Akt、PI3K蛋白的表达,且存在浓度依赖关系,但对p-JNK、ERK1/2、p38、JNK蛋白的表达没有影响。研究揭示了源于L.acidophilusCICC6005分泌的37 ku和67 ku胞外蛋白表现出显著的抑制HT-29细胞增殖的功能,其机制可能与调控MAPK和PI3K-Akt两个信号通路中几个关键的靶点蛋白的活化水平相关,并且,食用嗜酸乳杆菌其分泌的胞外蛋白质将发挥维护肠道健康的效果[33-34]。

3.1.2 调节细胞因子的产生 Schlee等[35]研究的7种乳酸菌株和VSL#3(a probiotic cocktail of four lactobacilli,three bifidum and one streptococcus species)证实益生菌经过诱导产生一种抗菌肽(防御素)能够稳定肠道屏障功能,并且在NF-κB和AP-1诱导及MAPKs、ERK、p38和JNU等多种激酶参与下分泌胞外蛋白—人β-防御素-2(hβD-2),使得IL-8的分泌量增加。

乳酸菌分泌的胞外蛋白还具有调节免疫细胞活性的作用。Konstantinov等[26]研究了嗜酸乳杆菌NCFM(LactobacillusacidophilusNCFM)释放的蛋白SlpA可以与特异性受体DC-SIGN结合诱导DC分泌IL-10,可用于预防结肠炎的发生。实验还发现LactobacillusacidophilusNCFM突变体释放的胞外蛋白SlpB,可以诱导DC分泌IL-12p70、TNF-α、IL-1β。最近报道了[36]一种费氏丙酸乳杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)的研究,费氏丙酸乳杆菌传统上用作一种干酪成熟发酵剂的有益的细菌,在近期有关该菌的益生能力的研究发现,它基于释放一种在小鼠体内具有保护急性结肠炎的、免疫调节功效的有益代谢产物,从而有利于这种菌附着在宿主的细胞上而发挥肠道保护作用。最重要的是费氏丙酸乳杆菌CIRM-BIA 129(P.freudenreichiiCIRM-BIA 129)表达的表层蛋白质(surface-layer proteins),这种蛋白质是完成一些功能所必需的,并具有菌株的依赖性。

3.2 分泌胞外蛋白的双歧杆菌

双歧杆菌是动物肠道内具生理性功能的细菌之一,它粘附于肠道粘膜上皮细胞后,定居形成稳定的菌群,从而发挥其生理功能,主要体现在对宿主的生物屏障和生物拮抗作用、增强免疫、延缓机体衰老作用和抑制肿瘤作用等方面[29]。

3.2.1 抑制肿瘤和增强粘膜屏障功能 Mitsuma等[37]在双歧杆菌BB-12(BifidobacteriumlactisBB-12)生长稳定期成功分离出一种由Cys、His、Trp、Pro和Arg五种氨基酸组成的短肽CHWPR,CHWPR可以穿过细胞膜与胞浆的核受体RORγ特异性结合,再与基因区域的启动子相结合,在HL-60细胞株中可以增强c-myc和IL-6的基因表达,并且相对浓度较高的CHWPR对提高c-myc和IL-6的表达是有利的,但作用时间短而且消失快,该结果对解决肠道肿瘤疾病具有前景。

Ewaschuk等[38]在以IL-10缺陷性小鼠为模型的研究中发现,婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)分泌的一种胞外蛋白可以使上皮细胞紧密连接蛋白(TJPs)和TER增加,进而可以减少结肠癌发生的机率,并且还能降低结肠通透性,减弱炎症反应,从而增强粘膜屏障。Gilad等人[39]开展了动物双歧杆菌胞外蛋白质组的研究,使用2D结合MALDI-TOF MS/MS对动物双歧杆菌胞外蛋白质进行鉴定,发现在鉴定的74种不同的蛋白质中有31种在细胞表层或细胞外扮演了它们各自的生理学的角色,包括细胞壁代谢的蛋白质及氨基酸、低聚糖结合蛋白质;18种蛋白质具有同人体上皮细胞相互作用,或是与细胞外基质蛋白质相互作用的特点。这些蛋白质的鉴定预示着在细菌和宿主之间能很好地为蛋白质介导的交互作用定向的研究铺平道路,也必将会达到增强人类认识益生菌的作用模式和促进机体健康的目的。

3.2.2 免疫调节 Hoarau等[23]在对短双歧杆菌C50(BifidobacteriumbreveC50)分泌的胞外蛋白研究中发现,它可以与TLR-2结合,通过不同通路途径导致DC生理上的改变。一是可以增强树突细胞的存活能力,这个过程是由PI-3K通路介导完成的;二是可以促进树突细胞成熟,这个由p38和PI-3K通路介导,而且分别通过ERK、p38、PI-3K通路和p38、GSK-3通路可以增加IL-10、IL-12的分泌量。

Ivanov等[40]研究了定植在人体消化道的长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)分泌的一种胞外蛋白质,也是丝氨酸蛋白酶抑制剂。通过研究该胞外蛋白的生化特性发现,这种丝氨酸蛋白酶抑制剂可以有效抑制胰弹性蛋白酶和嗜中性粒细胞弹性蛋白酶,其中嗜中性粒细胞蛋白酶可以导致肠道急性炎症,因此,这种抑制剂是直接作用并参与炎症反应的酶,在防止肠道疾病的发生方面表现出明显的作用。

3.3 一些肠道有益菌分泌胞外蛋白的研究

在人体肠道中含有大量的大肠杆菌,有些菌对人体健康起着重要的作用。尼氏大肠杆菌1917(EscherichiacoliNissle 1917)是其中一种研究的比较好的菌株[41]。与其他肠道益生菌不同,它是一种革兰氏阴性细菌,在常规抗生素应用之前,这个菌株已经在市场上用于治疗腹泻接近100年的时间[42]。在增强粘膜屏障功能方面的研究表明,具有益生功能的一些大肠杆菌属的菌株是由于在肠道内能够分泌表现很好生物学功能的蛋白质而发挥作用的。Schlee等[43]研究了在NF-κB和AP-1诱导下,益生菌大肠杆菌Nissle 1917(probioticEscherichiacoliNissle 1917)可以分泌的一种胞外蛋白—鞭毛蛋白,它可以诱导hβD-2和IL-8的表达,其中,hβD-2是上皮细胞分泌的抗菌肽,它可以抵制致病菌对上皮细胞的粘附和侵袭,因此可以增强粘膜屏障功能。

贾彦等人[44]探究了不同浓度的杜仲水提液对嗜酸乳杆菌CICC6005增殖以及对其发酵过程中胞外和胞内蛋白含量变化的影响,结果表明当杜仲水提液浓度为0.125 g/mL时,对其增殖有明显的促进作用,菌体生物量最大,同时在此浓度下菌体胞外蛋白和胞内蛋白含量也达到最大值,且经分离纯化后胞外蛋白两组分分子量分别为67 ku和31 ku,胞内蛋白两组分分子量分别为57 ku和17 ku,揭示了适宜浓度的杜仲水提液对L.acidophilusCICC6005的增殖起到了一定的促进作用,并对其发酵产物的组成产生了一定的影响。

3.4 益生菌剂与胞外蛋白的分泌的研究

将已知有益的菌种,经特殊工艺(如培养、发酵、干燥等)制成纯菌粉,与一定量的益生元(Prebiotics)混合,制成的具有一定功能的生物制剂,即为益生菌剂。对益生菌剂而言,目前已从开发高效全能的单菌株逐渐转化成多效的复合菌粉,其中较为出名的是益生菌剂VSL#3,该益生菌剂在治疗肠易激综合征[45]和溃疡性结肠炎[46]的效果尤为突出。VSL#3还可改善食源性肝纤维化[47],可见益生菌剂在功效发挥上有更加宽广的前景。Caballerofranco等[48]研究表明VSL#3可以诱导粘蛋白基因的表达,并增强在结肠上皮细胞粘蛋白的分泌能力,并且乳杆菌最利于粘蛋白的分泌。而且,Madsen等[49]研究发现,VSL#3中的一种或几种菌属能释放一种可溶性蛋白质,提高肠上皮的物理屏障功能。此外,本实验室探讨了益生菌剂(Probotic Preparations,PPrs)(含抗性糊精、菊粉、水苏糖、麦芽糊精、植物乳杆菌LP45(Lactobacillusplantarum)、嗜酸乳杆菌La28(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳杆菌YMC1069(Lactobacilluscasei)、两歧双歧杆菌TMC3115(Bifidobacteriumbifidum)对肥胖大鼠脂代谢水平的影响,研究结果表明,PPrs可降低大鼠体重增长速率,降低肾脂、睾脂指数,控制肥胖状态,缓解肝脏脂肪变性和脂肪浸润;重要的是,研究还证实该益生菌剂的摄入可显著地下调3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)mRNA表达量,上调胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)mRNA、低密度脂蛋白受体(LDL-R)mRNA、磷酸化AMP活化蛋白激酶(p-AMPK)蛋白表达量,有效地调节脂代谢过程中内源性胆固醇的合成,促进胆固醇向胆汁酸代谢,改善肥胖大鼠的血清和肝脏脂代谢指标,从而达到降脂功能。可见益生菌剂在功效发挥上有更加宽广的前景。因此,开发新功效益生菌剂和研究益生菌剂发挥功效的生物学组分及机理具有重要意义。

4 目前尚存在的问题

从益生菌施惠于人类健康的角度出发,有价值的研究与临床上的功能表现均是主流的,但有研究表明在以溃疡性结肠炎动物模型为对象,鼠李糖乳杆菌LGG可以缓解和预防IBD的复发,但当以LGG为辅助剂,在治疗克罗恩病的儿童时并没有缓解病情的复发[50]。这些结果表明了使用益生菌疗法难以确定在胃肠道中益生菌的生物利用度的现实问题。此外,因为在一些免疫力功能低下[51]或年龄很小[52]的患者中使用活菌会导致菌血症的发生,所以,使用活益生菌要引起关注。还有,尽管研究已表明益生菌的有益功效归功于益生菌的胞外蛋白,尚需要进一步研究这些蛋白质分子在细胞(包括上皮细胞和免疫细胞)上的精确作用机制,这将有利于了解益生菌的代谢产物对人体产生的有益的影响,对胃肠功能紊乱、过敏和自身免疫性疾病的治疗会有所帮助。综上所述,虽然益生菌分泌的胞外蛋白与肠粘膜免疫的关系是非常密切的,但只有在分子水平上就胞外蛋白对免疫的影响进行深入地研究,才能更有力地为胞外蛋白对机体健康的促进作用提供佐证。

5 展望

分泌胞外蛋白的益生菌以及开发一种相关的治疗方案一直是该领域的研究热点,胞外蛋白作为一种生物活性蛋白,较好的生物相容性和广泛的生物学功能决定了其潜在的商业价值和开发的可行性;并且,胞外蛋白可以作为功能性食品用于肠道疾病的生物免疫治疗,为解决肠道疾病等常见、难愈疾病提供了一条新的、有效的途径。因此,使用益生菌分泌的胞外蛋白来治疗肠道相关疾病不失为一个较好的生物治疗药物方案,围绕肠粘膜来研究某一种胞外蛋白对肠道疾病的影响将具有重要的现实意义。