硫代乙酰胺诱导的急性肝损伤大鼠肝组织Norrin/Frizzled-4表达的变化*

胡建鹏，宋正己，李玉莲，寻琳婷，赵雪茹，张镕

急性肝损伤（acute liver injury）是指在无慢性肝病基础上，由多种病因导致肝脏细胞损伤，肝脏解毒、生物转化、合成和排泄等功能出现障碍。造成急性肝损伤的原因主要包括病毒感染、休克缺血、食物或药物中毒、放射线损伤、妊娠、酒精摄入过量以及肝外组织器官功能障碍间接造成肝损伤等。肝脏有着极强的再生和修复能力，去除急性肝损伤病因后，在短期内组织重建即可完成，组织结构恢复。Norrie病是一种先天性视网膜血管发育不全，视网膜血管扩张、血管增殖、纤维化和视网膜脱离的疾病，是由Norrin蛋白相关基因（Ndp）缺陷，正常视网膜血管发育过程中断，视网膜处于缺氧状态，启动了病理性血管新生而导致的疾病[1，2]。Norrin蛋白是一种小分子的分泌型糖蛋白质，能通过自分泌和/或旁分泌方式作用于血管内皮细胞和血管周围细胞，决定靶细胞的移行、增殖和血管网络形成等生物行为，在中枢Norrin还有促神经生长因子样作用[3，4]。在Norrin基因缺陷小鼠引入外源性Norrin基因可以恢复视网膜血管网的形成，并且所形成的视网膜血管结构，包括超微结构都是正常的，能完全恢复正常的视网膜血管网络结构和维持视网膜功能[5]。近年国外研究报道，活化的肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）存在 Wnt/β-catenin 信号通路的激活，阻断该信号可抑制HSC的活化[6]。已有研究认为细胞外Norrin蛋白通过与细胞膜上特异性跨膜受体卷曲蛋白4（Frizzled-4）结合，能介导Norrin/Fri-zzled-4信号通路，调控转录过程，与血管内皮细胞和血管周围细胞的迁移、增殖和血管网络形成相关。Norrin/Frizzled-4在血管新生（angiogenesis）及发育过程中起到关键性作用[3，7，8]。近年来，有关 Norrin基因在正常血管发育中的作用研究已取得突破性进展，但Norrin/Frizzled-4信号在急性肝损伤组织血管新生和肝间质重建中的作用还鲜有报道。本研究采用硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）诱导大鼠急性肝损伤，观察了肝组织Norrin/Frizzled-4蛋白、血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和CD105表达的变化及其与肝组织血管新生之间的关系，以便进一步研究Norrin/Friz-zled-4信号在急性肝损伤间质重建中的作用及其调控途径。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂与仪器 健康SPF级雄性SD大鼠33只，体质量200±20 g，购自成都达硕生物科技有限公司，动物合格证号SCXK（川）2013-24。在云南省中医医院中心实验室无菌动物房饲养，适应1 w后开始实验。TAA购自美国Sigma公司；Nycodenz粉剂（挪威 Axis-Shield）；Hanks、D-Hanks、链蛋白酶 E（Solarbio）；Collagenase Ⅳ（美国 MP原装）；DNaseI（Roche）；检测 VEGF 和 CD105的ELISA试剂盒（R&B公司进口分装），SDS-PAGE凝胶配制试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天）；抗 Norrin和抗 Frizzled-4（Chem Cruz）。荧光显微镜、倒置相差显微镜（德国莱卡）；超低温冰箱、小型台式离心机（美国Thermo）；电泳仪、小型Trans-blot转达印槽组件（美国Bio-rad）；红外双色激光成像系统Odyssey Clx（美国 LICOR）；Epoch连续波长酶标仪（美国Bio-Tek）；漩涡混合仪（上海QT-1）；SW-CJ-2F标准化超净工作台。

1.2 原代肝星状细胞的分离 取1只大鼠，正常饲养至450±50 g后，用Hanks液在体灌洗大鼠肝脏，离体后用0.05% Ⅳ型胶原酶、0.02%链蛋白酶E和0.05%DNaseI灌注、消化大鼠肝脏，经12%Nycodenz密度梯度离心，收集肝星状细胞层，洗涤、离心后，提取细胞总蛋白。

1.3 急性肝损伤动物模型的制备 将32只大鼠随机分成正常对照组（N组）8只，根据大鼠体质量给予 0.9%生理盐水5 ml·kg-1·d-1腹腔注射；TAA 诱导模型组（M组）24只，根据大鼠体质量给予TAA 250 mg·kg-1·d-1腹腔注射，1 次 /d，连续注射 3 天，诱导急性肝损伤。于开始注射TAA后的第10 d和第17 d，分别给予10%水合氯醛麻醉。在N组，处死大鼠4只，在M组，处死6只，取肝组织，经4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，常规HE染色，显微镜下观察。

1.4 血清CD105和VEGF水平检测 麻醉大鼠后开腹，经心脏取血，3500 r/m离心15 min，取上清，采用ELISA法检测。根据标准曲线，求出各样品CD105和VEGF水平。

1.5 肝组织Norrin和Frizzled-4蛋白表达检测 采用Western blot法，取肝右叶最大横切面处组织100 mg，加入含1%PMSF的RIPA裂解液（增强型，P0013B）1 mL，冰上充分匀浆，离心后取上清。测定蛋白浓度，蛋白定量后计算各样品体积，确保每个蛋白样品的上样量一致。按4：1的比例加入5×SDS-PAGE Ladding buffer，混匀。沸水浴致蛋白变性10 min，冷却后，置于-70℃冰箱，待用。配制体积分数为12%SDS-PAGE分离胶和5%浓缩胶，灌胶凝固后，取Marker 8μL，蛋白样品 25 μL（50μg），依次排序上样，用恒压45 v电压，电泳时间约30 min，待Marker显示样品经过浓缩胶后将恒压调至60 v，继续电泳，确定已将目的蛋白条带分开，停止电泳。按照转膜夹阴极（黑色面）、1层海绵、2层滤纸、凝胶、PAGE膜、2层滤纸、1层海绵、转膜夹阳极（白色面）的顺序，一层层赶走气泡，夹好固定后，将转膜夹放入转膜槽，放入冰袋，盖好盒盖后，置于4℃冰箱，恒压90 v转膜90 min。转膜结束后，将目的蛋白条带剪下，放入用TBST配制的3%牛血清蛋白封闭液中，做好标记，置于摇床上，室温摇晃封闭1～1.5 h。分别加入抗Frizzled-4多克隆抗体（1：200）、抗 Norrin多克隆抗体（1：200）和抗 GAPDH 单克隆抗体（1：2000），摇床上4℃冰箱中孵育过夜。次日，用TBST洗膜3次，每次 10 min。加入相应酶标二抗（1：10000），用TBST洗膜3次，每次10 min。提前20 min打开红外双色激光成像系统，将膜放入扫描仪内，扫描成像。以Norrin/Frizzled-4条带灰度值与内参GAPDH条带灰度值的比值估计Norrin/Frizzled-4蛋白相对表达量。

1.6 统计学处理 应用Excel 2007和SPSS 18.0软件，计量资料以（±s）表示，采用方差分析及t检验，P＜0.05为组间存在显著性差异，P＜0.01为存在非常显著性差异。

2 结果

2.1 大鼠生长情况 对照组大鼠活动正常，毛发光泽，饮食饮水及大小便正常，饲养期间体质量稳定增加；24只TAA诱导急性肝损伤模型大鼠于开始注射 TAA 后的第 3 d、4 d、5 d、6 d，分别死亡 2只、5只、3只、1只（45.8%）；给药期间动物活动减少，食欲不振，嗜睡，毛发蓬乱无光泽。在注射TAA后体质量急速下降，停止注射TAA 2 d后又缓慢上升，但始终低于对照组。

2.2 各组肝组织病理学表现 正常组动物肝小叶存在，以中央静脉为中心，肝索呈放射状排列、整齐（图1A）；TAA诱导急性肝损伤1 w，大鼠肝细胞部分肿胀坏死，细胞质疏松化，细胞核内出现空泡（图1B）；TAA诱导急性肝损伤2 w，大鼠肝细胞肿胀严重，排列紊乱，胞内出现大空泡，细胞核体积变小，有炎性细胞浸润（图1C）。

图1 各组大鼠肝组织病理学表现（HE，40×）

2.3 血清CD105和VEGF水平比较 与正常对照组比，急性肝损伤1 w组大鼠血清CD105和VEGF水平显著升高（P＜0.05），急性肝损伤2 w组大鼠血清CD105和 VEGF 水平极显著升高（P＜0.01），且 1 w组和2w组比较，血清中VEGF水平也有差异显著（P＜0.05，表1）。

表1 各组血清CD105和VEGF水平（±s）比较

表1 各组血清CD105和VEGF水平（±s）比较

与对照组比，①P＜0.05，②P＜0.01

只 CD105（ng/mL） VEGF（pg/mL）正常对照 8 2.175±0.046 61.476±0.388急性肝损伤1 w 13 2.359±0.067① 62.093±0.54急性肝损伤2 w 8 2.421±0.033② 64.520±0.252②

2.4 肝组织Norrin/Frizzled-4蛋白表达情况 结果显示，原代肝星状细胞和正常肝组织不表达Norrin蛋白或Frizzled-4蛋白，或表达量很低；急性肝损伤1 w和2 w组肝组织Norrin蛋白相对表达量显著高于正常肝组织，差异有统计学意义（P＜0.01，图2、图3）。急性肝损伤2 w组Norrin蛋白表达量显著低于1 w组（P＜0.05），说明急性肝损伤后肝组织Norrin蛋白表达逐渐降低。正常大鼠肝组织Frizzled-4蛋白高表达，提示除HSC外肝脏内可能还存在其他间质细胞或实质细胞参与Frizzled-4蛋白的表达。急性肝损伤大鼠肝组织Frizzled-4蛋白相对表达量显著高于正常肝组织，差异有统计学意义（P＜0.01，图 2、图 3）。

图2 各组肝组织Norrin/Frizzled-4蛋白相对表达量比较

图3 各组肝组织Norrin/Frizzled-4蛋白表达

3 讨论

本研究发现急性肝损伤大鼠血清CD105和VEGF水平升高，说明肝组织代偿性启动血管新生，促进肝间质重建[9]。在急性肝损伤时，库普弗细胞和内皮细胞被激活并产生 TGF-β1、PDGF、VEGF、肿瘤坏死因子（TNF）等细胞因子以及炎性介质和活性氧，促使静止的HSC活化，活化的HSC具有血管平滑肌细胞特性，能促进新生血管的构建[10-13]。

经典WNT/β-catenin信号通路是细胞外配体（WNT蛋白家族）作用于跨膜卷曲蛋白-低密度脂蛋白相关蛋白复合受体（Frizzled/LRP），使Dishevelled蛋白被激活。当β-catenin降解复合体被抑制后，β-catenin信号得以在胞浆内累积并传导至细胞核，与核内转录因子TCF/LEF1相互作用，激活下游靶基因的转录，引发生物学效应[14-16]。Norrin蛋白在结构上和Wnt蛋白无关，但也是Frizzled-4蛋白在细胞外的一种配体蛋白，能激活Norrin/Frizzled-4信号通路。Norrin/Frizzled-4和Wnt/β-catenin信号通路的协同分子和靶分子不尽相同[17]，Norrin/Frizzled-4信号转导通路在血管发生和功能维护中起核心作用[3，14]。

本研究结果显示，Norrin蛋白在肝星状细胞和正常肝组织中表达量低，损伤初期其表达量上调，之后又有所下降。除HSC外，肝脏内可能还存在其他间质细胞或实质细胞参与Frizzled-4蛋白的表达[18]。文献报道Norrin/Frizzled-4信号转导通路在血管发生和功能维护中起核心作用[3，14，19]。我们还观察到Frizzled4蛋白表达与CD105和VEGF具有同步性，急性肝损伤均可显著上调其表达量，参与急性肝损伤后的血管新生，推测Norrin/Frizzled4和WNT/β-catenin信号在肝损伤血管新生和间质重建的不同时期发挥作用，而且其作用机制可能是在急性肝损伤后上调CD105和VEGF表达，促进血管新生和组织修复。

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