线栓法制作大鼠局灶性缺血性脑损伤模型方法研究

1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730030；2.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050

急性脑血管病又称脑卒中，其发病率逐年上升，已成为第一大致残病因和第二大致死病因。流行病学调查结果显示[1]，我国每年新发脑卒中病例约有200万，年脑卒中发病率约为(116～219) /10万人口，年脑卒中死亡率约达到发病率的一半：( 58～142 ) /10万人口。脑卒中又可分为缺血性脑卒中(ischemic Stroke, IS)和出血性脑卒中(Hemorrhagic Stroke )[2]，其中缺血性脑卒中占全部脑卒中发病率的80%左右，并且其发病率随年龄的增长而增高。因此，了解缺血性脑卒中的发生发展和防止措施具有重要意义。本实验使用线栓法阻断大鼠大脑中动脉(Middle Celebral Artery,MCA)制作缺血性脑损伤的方法，制作成熟的大鼠缺血性脑损伤模型是该研究的基础。然而，该模型的方法已有多种，在前人工作的基础上进行改良和反复验证，结合在其他实验室的技术，现将本实验的造模过程和结果报道如下。

1 仪器与材料

1.1 动物 SPF级SD雄性大鼠，60只，体重260～280 g。由甘肃中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(甘)2015-0002。饲养于甘肃中医药大学实验动物中心SPF级实验室，室温(23±2)℃，湿度45%～55%，自由饮水处理原则。

1.2 材料 水合氯醛(天津市光复精细化工研究所)；磷酸盐标准缓冲液(批号：1114A029，北京索莱宝科技有限公司)；鱼线(爱鱼者德国原丝鱼线)；微型动脉夹(美莱医疗器械)；24孔板(海门市春博生物实验器械厂)。

2 方法

2.1 造模与分组 将直径0.235 mm的鱼线用锋利的手术刀片裁剪为长约3～4 cm/段，用酒精灯将鱼线一端轻微烧一下(目的把鱼线头端烧圆滑，切记把鱼线头端烧成钉子帽状。)之后用黑色Marker笔，用刻度尺比量，从鱼线头端开始计算，距离18～20 mm处对线栓做标记。把制作好入选的线栓放入实验盒子内备用。按照3～5 mL/kg体重的量腹腔注射10%水合氯醛麻醉动物，待大鼠麻醉充分将大鼠平躺与手术操作台上。术前常规消毒，在大鼠颈部正中处，从下颌下1.5～2 cm开始，做一大约长为3 cm左右的切口，之后小心剥离出大鼠的右侧颈总动脉，颈外动脉，颈内动脉三条动脉分叉处，将颈外动脉离心处永久性结扎，用微型血管夹夹住颈总动脉和颈内动脉，在颈外动脉向心处打一活结，用于固定线栓，在颈外动脉活结和死结之间剪一小口，剪破血管时注意血管剪与血管之间呈45°角，剪口宽度不超过总血管的1/2。将准备好的线栓从切口处插入颈外动脉向心端，到达颈总动脉与颈内、外血管分叉处，绕过分叉处进入颈内动脉，此时剪断颈外动脉死结的向心处，取开颈内动脉的血管夹，调整线栓角度，顺势经过颈内动脉进入大脑中动脉。在从颈总动脉分叉处记起，线栓大约进入18～20 mm处时，线栓会受到轻微阻力，停止插线栓。扎紧在颈外动脉向心处活结。2 h后拔出线栓至颈总动脉分叉处。待大鼠清醒后行模型评分，将制作成功的模型按照随机数字表分组，根据 1 d、3 d、7 d、14 d分为四组，每组各10只。其中未活到预计天数者，随时补充，保证每组10只。假手术组在下颌处打开切口，之后小心剥离出大鼠的右侧颈总动脉，颈外动脉，颈内动脉三条动脉分叉处，不做任何处理，缝合切口。

2.2 观察指标 对各实验组大鼠采用Bederson[3]等0～5分评分标准进行神经功能评分。标准如下:0分-神经功能完全正常，活动自如；1分-对侧(左前肢)肌力下降，呈内收屈曲状；2分-对侧(左侧)自主旋转或划圈，平地时；3分-对侧(左侧)倾倒，平地时；4分-昏睡或者昏迷的意识障碍；5分-大鼠的死亡。其中1-3分为成功模型。

2.3 标本采集 取成功MCAO模型根据1 d、3 d、7 d、14 d行缺血再灌。采用10%水合氯醛按照3～4 mL/kg的剂量对大鼠进行腹腔注射麻醉。待麻醉成功后，使用实验动物电动剃须刀将麻醉成功的大鼠胸腹部的毛发剪去，将大鼠仰卧于手术台上，四肢固定，常规消毒铺巾，按照无菌原则手术操作；沿前正中线剪开皮肤、钝性分离皮下组织，组织剪从胸骨柄正中剪开，使用止血钳夹闭出血动脉止血，充分暴露大鼠心脏、主动脉，从心尖处插入动静脉留置针(针头内包含针芯)至主动脉根部，拔出针芯，连接输液管，剪开右心耳，立即用含有肝素(10 μ/mL)的生理盐水行心脏灌注，待大鼠肝脏组织颜色变淡，且从右心耳出口流出的灌注液由红色逐渐变淡并呈完全清亮为止。将大鼠俯卧于手术台上，固定大鼠头部、四肢，常规消毒铺巾，按照无菌原则手术操作，沿头部背侧中线剪开皮肤，分离皮下组织，剥离骨膜，止血钳咬除大鼠顶部颅骨，小心分离取出大鼠脑组织，取出置于-80 ℃冰箱保存留用。

2.4 MCAO再灌注模型HE染色 石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，苏木素染色4 min，流水冲洗，1%的盐酸酒精溶液分化5s，流水冲洗，伊红染色2 min，水洗3次，梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

2.5 MCAO再灌注模型TTC染色 ①TC染液的配置：用0.1 mol/LpH7.5的磷酸缓冲液配制成0.5%浓度的TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)，并调溶液的pH到6.8～7.2。②切片：将在-20 ℃的冰箱中保存的脑子取出，一般切成5～6片, 每隔2 mm 切一片。第1刀在脑前极与视交叉连线中点处；第2刀在视交叉部位；第3刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄与后叶尾极之间,总共切6片。③将切片置于TTC 中， 37 ℃的30 min，4%多聚甲醛固定12 h。之后将数据输入Image Pro Plus5.0软件进行处理，确定缺血部位的梗死面积。

3 结果

3.1 大鼠神经功能评分结果 采用Bederson等0-5分评分标准进行神经功能评分。实验点选取，2 h、1 d、3 d、7 d、14 d。实验对象：每只成功模型大鼠。神经功能评分随着脑缺血再灌注的延长而慢慢恢复。结果是跟空白组比较，脑缺血再灌2h神经功能评分3～4分(P<0.01)；1 d神经功能评分3分(P<0.01)；3 d神经功能评分2～3分(P﹤0.01)；7 d神经功能评分1～2分(P<0.05)；14 d神经功能评分0～1分(P>0.05)。结果如图1所示。

3.2 MCAO模型再灌HE染色结果 空白对照组和假手术组HE染色切片呈红色，缺血损伤再灌注组正常组织HE染色呈红色，梗死灶呈白色，两者界限明显。正常组的细胞排列整齐，脑白质组织结构正常，细胞核饱满无固缩，假手术组与之相比较无明显变化。M1组染色逐渐变浅，脑白质结构变得疏松，细胞核固缩并且细胞排列紊乱，随时间增加表现明显。M7组后染色相对清晰，脑白质结构逐渐正常，细胞核固缩现象明显减轻，细胞排列逐渐整齐。M14基本恢复正常。如图2所示。

3.3 MCAO模型再灌TTC染色结果 成功的脑缺血再灌注模型因大脑中动脉阻塞缺血而导致脑组织坏死，坏死的脑组织不能被TTC染色而呈现苍白色，未缺血的部分被TTC染成红褐色。如图3所示。与正常组相比较，模型14 d组差异无统计学意义(P﹥0.05)，随着时间增加，梗死面积逐渐增大，模型1 d，3 d差异有统计学意义(P﹤0.01)，7 d梗死面积差异有统计学意义(P﹤0.05)。7 d后梗死面积逐渐缩小。见表1。

表1 各组梗死面积均值

组别梗死面积空白组假手术组模型1d000.36±0.03**模型3d0.48±0.05**模型7d0.50±0.08*模型14d0.18±0.02

注：与正常组比较,*P﹤0.05,**P﹤0.01。

4 讨论

缺血性脑损伤发病率的逐年上升，引起了国内外学者对其发病机制和治疗方法的高度重视，作为该病研究的基础，用线栓法制作成功的缺血性脑损伤模型具重要作用。应用线栓法阻断大鼠大脑中动脉造成缺血性脑损伤模型方法有多种，其后手术方法也有多种改进，目的是为了手术创伤更小，操作更简单，成功率高，死亡率低。之前最常用的造模方法是从颈总动脉剪一“V”字行切口[4]，从颈总动脉插入进入大鼠大脑中动脉。该方法虽然不用分离颈内动脉，在血管机械刺激方面较小[5]，但是该方法很难从颈总动脉进入大鼠大脑中动脉，线栓大约进入10 mm处就不能进入，期间调整角度，反复插入，反而加重损伤，增加死亡率。

实验结果显示：从颈外动脉插入绕过分叉路口进入颈内动脉时更易进入大鼠大脑中动脉，解决了很多学者用之前的方法很难进入大鼠大脑中动脉而导致模型评分低和死亡率高的缺点。并且造模时间更短，效率更高，成功率高，完成一只动物造模仅用10～15 min,死亡率低至10%以下。本实验同时表明，造模2 h后拔出鱼线，随时间增加梗死面积逐渐增大，但到7 d后，梗死面积逐渐减小，到14 d时神经功能得到改善，故而说明，在发生缺血性脑损伤的同时，内源性的代偿机制也被触发，此过程可见血管生成。本实验结果为后续缺血性脑损伤机制和治疗方面的研究提供基础和思路。

[1]Go AS,Mozaffarian D,Roger VL,et al. Heart disease and stroke statistic-2014 update:a report from the American Heart Association[J]. Circulation，2014,129(3):e288-292.

[2]Ding D, Lu CZ, Fu JH, et al. Predictors of vascular events after ischemic stroke: the China is chemic stroke registry study[J]. Neuroepidemiology，2010, 34(2): 110-116.

[3]Bederson JB, Pitts LH, Tsuji M, et al.Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic evaluation[J]. Stroke，1986，17(3): 472- 476.

[4]关云谦，孙明，徐超.大鼠颈内动脉线栓法制备局灶性脑缺血模型及影响因素[J].国外医学脑血管疾病分册，2001(9):151- 153.

[5]Aspey BS,Taylor FL,Terruli M,et al.Temporary middle cerebral artery occlusion in the rat;consistent protocol for a model of stroke and reperfusion[J].Neuropathol Appl Neumbioh，2000(26):232-242.