HOX基因在喉癌组织与癌旁正常组织中的表达谱研究*

曲灵美 徐光达 李昕 于洋 印明娜 金宏林 呼晓 孙亚男

HOX基因(homeotic genes)在不同的染色体上成簇排列又称HOX基因簇，是同源盒基因（homeobox gene）家族中的一员，是一类重要的转录调节因子，通过其同源域识别并结合特异的DNA序列，在机体细胞的增殖、分化等方面发挥重要的调控作用，进而在某种程度上决定了胚胎的发育和后期机体器官的发育。由于HOX基因的调控作用，研究人员对其与人类肿瘤之间的相关性进行了深入研究。实验表明，HOX基因的变异与发育畸形密切相关，同时还与一些肿瘤，如白血病、乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、结直肠癌等的发生、发展有着密切关系[1-5]。随着对HOX基因研究的不断深入，HOX基因可能成为癌症早期诊断和基因治疗新的分子靶标点。我们应用基因芯片技术研究HOX基因簇在喉癌中的表达谱，进而筛选出与喉癌发生，发展密切相关的LncRNA与mRNA，为喉癌基因治疗提供新的理论依据和治疗靶点。

资料与方法

1 一般资料

选取哈尔滨医科大学附属第二医院耳鼻咽喉头颈外科2014年1月～2014年5月手术切除的5例喉鳞癌组织标本及癌旁正常组织为实验样本。所有病例均为经病理确诊的初发喉鳞癌患者，并且全身检查均未发现远处肿瘤转移，术前都未施行放疗、化疗或其它方法治疗。本试验所有选取的实验组喉鳞癌组织标本及癌旁正常组织样本的收集均征得患者同意，患者本人签署知情同意书。选择美国 Arraystar公司提供的 8×60K Human LncRNA Microarray 2.0版芯片，此芯片收录了目前最全的LncRNA与蛋白编码基因(mRNA)，杂交实验可以同时检测LncRNA和mRNA的表达水平。

2 总RNA的抽提与质检

按着Trizol试剂盒分别提取5例喉癌组织及癌旁正常组织中的RNA，使用NanoDropND-1000型紫外分光光度计测定组织总RNA纯度，并做进一步的RNA完整性检测：琼脂糖凝胶电泳质检。

3 cRNA合成，标记，与杂交反应

利用Agilent公司提供的逆转录试剂盒及单色标记试剂盒，合成标记cRNA，通过使用紫外分光光度计检测荧光标记率，后利用Agilent公司提供的杂交系统进行杂交反应。

4 芯片扫描及数据分析

采用Agilent Scanner G2505C扫描仪进行扫描芯片，单色扫描后将图像导入图像分析软件（安捷伦特征提取软件），经过排列，提取得到基因表达的荧光信号强度值，应用计算机软件进行标准化处理分析。获得标准化的芯片表达数据，再把数据输入到Agilent GeneSpring GX软件（version 1.5.1）进行分析，图像定量和标准化数据处理最后以表格的形式展示mRNA和LncRNA表达数据，按Fold Change 2.0,P-value 0.05值筛选，筛选出差异表达的mRNA和LncRNA重新制作成差异表达的mRNA和LncRNA数据。

结果

经过计算机数据分析，我们获得到LncRNA和mRNA的表达数据，在喉癌组织中有表达的HOX基因簇的LncRNA为278条，mRNA为178条，按着差异表达的标准：Foldchange 2.0 P-value 0.05筛选得到两组之间差异表达的LncRNA和mRNA。筛选出差异表达的HOX基因簇的LncRNA有18条，表达 上 调 的 有 8 条 ：HOXA4-66、HOXA10-82、HOXA11-86、HOXA13-100、HOXB9-206、HOXB9-205、HOXD12-3、HOTAIR。10 倍以上变化的有 2条：HOXA11-86、HOXB9-206。4倍以上变化的有1条：HOXD12-3。2倍以上变化的有5条：HOXA4-66 HOXA10-82、HOXA13-100、HOXB9-205、HOTAIR。表达下调的有 10 条：HOXA11-92、HOXA13-97、HOXB4-171、HOXB4-173、HOXB9-187、HOXC5-254、HOXC9-131、HOXC11-114、HOXD1-49、HOXD9-16，其中4倍以上变化的有1条：HOXC5-254，2 倍以上变化的有 9 条：HOXA11-92、HOXA13-97、HOXB4-171、HOXB4-173、HOXB9-187、HOXC9-131、HOXC11-114、HOXD1-49、HOXD9-16。上调倍数最大的LncRNA：HOXA11-86(Foldchange：17.75)，下调倍数最大的LncRNA：HOXC5-254(Foldchange：7.65)。同时检测到差异表达HOX基因簇的mRNA有17条，表达上调的有15条，10倍以上变化的有3条，4倍以上变化的有5条，2倍以上变化的有7条。表达下调的有2条，其中4倍以上变化的有1条，2倍以上变化的有1条。上调倍数最大的 mRNA：NM_000523(Foldchange：21.47)，下调倍数最大的 mRNA：NM_018952(Foldchange：4.59)，（见表 1-表 4）。

表1 喉癌组织与癌旁正常组织相比，10倍以上表达上调的HOX基因簇LncRNA

表2 喉癌组织与癌旁正常组织相比，下调倍数最大的的HOX基因簇LncRNA

表3 喉癌组织与癌旁正常组织相比，10倍以上表达上调的HOX基因簇mRNA

表4 喉癌组织与癌旁正常组织相比，下调倍数最大的的HOX基因簇mRNA

讨论

我们研究发现，同一条基因HOXB9转录的不同LncRNA表达上调变化倍数不同：HOXB9-206表达上调12.8倍，HOXB9-205表达上调2.9倍。同一条基因转录的不同LncRNA表达上调或下调的情况也有所不同：HOXA11-86表达上调，HOXA11-92表达下调；HOXA13-100表达上调，HOXA13-97表达下调；HOXB9-206表达上调，HOXB9-187表达下调。这种看似矛盾的功能恰恰表明了HOX基因簇的功能复杂性。

这些LncRNA在喉癌组织中差异表达，提示它们可能参与了喉癌的发病过程，但LncRNA通过何种机制来影响喉癌的发生发展，目前尚不明确。这些上调表达的LncRNA可能通过某种途径作用于原癌基因，使其激活促进肿瘤发生，同理，下调表达的基因也可能通过某种途径作用于抑癌基因，使其灭活促进肿瘤的发生。癌症的发生和转移是一个多步骤、多因素、和多基因改变的过程,其中细胞增殖失控、细胞周期调控失常和较强的侵袭性被认为是癌症发生和转移的重要机制。有研究报道，某些LncRNAs调节细胞周期和细胞存活的作用可以促进细胞增殖，促进肿瘤的发生及/或发展。某些LncRNAs则具有抑制细胞过度生长、繁殖从而遏制肿瘤形成的作用。在癌症中通过表观遗传机制，许多抑癌基因常被LncRNA沉默。查阅文献，目前尚未发现除HOTAIR外的上述LncRNA与喉癌有相关性报道，说明HOX基因簇的LncRNA研究是一个崭新的领域，可能发现喉癌的新的信号传导通路，在“喉癌/喉癌旁组织”相互比对的芯片研究中得到的这些差异表达的LncRNA是否对喉癌的发生、分化乃至于整个喉癌具有相关意义？为解决这一问题，下一步我们要继续扩大疾病样本量，采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)来验证上述基因芯片的结果。

通过基因数据库得到差异表达的17条HOX基因簇 mRNA对应的基因为：HOXA5，HOXA7，HOXA9，HOXA10，HOXB6，HOXB7，HOXB9，HOXB13,HOXC4，HOXC5，HOXC6，HOXC8，HOXC10，HOXC11,HOXD1，HOXD4，HOXD13。查阅文献，目前尚未发现关于这些基因与人类喉鳞状细胞癌发生的相关报道，说明HOX基因簇的mRNA研究是一个崭新的领域，可能发现喉癌的新的信号传导通路。

综上所述，喉癌组织中这些差异表达的LncRNA与mRNA，可能通过不同的机制在喉癌的发病中起重要作用，但是具体机制目前还不明确。在这些差异表达的LncRNA与mRNA中，哪些发挥核心作用？它们的确切作用机制是什么？这些问题都需要在下一步实验以及今后的研究工作中去探索。

1 Bijl J,Krosl J,Lebert-Ghali.Evidence for Hox and E2A-PBX1 collaboration in mouseT-cellleukemia.Oncogene.2008,27:6356-6364.

2 Raman V,Martensen SA,Reisman D.Compromised HOXA5 function can limit p53 expression in human breast tumours.Nature.2000,405:974-978.

3 Ni ZY,Lou W,Leman ES.Inhibition of constitutively activated STAT3 signaling pathway suppresses growth of prostate cancer cell.Cancer Res.2000,60:1225.

4 ViderBZ,ZimberA,HirschD.Humancolorectal carcinogenesis is associated with deregulation of homeobox gene expression.Biochem Biophys Res Commun.1997,232(3):742-748.

5 Buccoliero AM,Castiglione F,DeglinnocentiDR.Hox-D genes expression inpedia -tric low-grade gliomas:real-time-PCR study.Cell Mol Neurobiol.2008,29:1-6.