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短密木霉、咪唑乙烟酸和种植大豆对土壤脲酶活性的影响1)

2018-03-27霍璐阳李志国刘晴刘宇彤董爱荣

东北林业大学学报 2018年3期
关键词:木霉烟酸脲酶

霍璐阳 李志国 刘晴 刘宇彤 董爱荣

(东北林业大学,哈尔滨,150040)

化学农药中高毒、高残留、难降解的农药是重要的环境污染物,不仅污染土壤环境和农作物,而且还进一步污染到地面水体和地下水以及海洋环境,直接威胁着人类的生存环境和身体健康。长期持续使用化学农药,会对环境和生物产生危害,而且由于耐药性的产生防治效果逐渐减弱,农药的残留也给生态环境带来许多负面影响[1]。

土壤酶是土壤的重要组成部分,参与土壤中所有的生化反应,在物质转化、能量代谢、污染土壤修复等过程中发挥着重要作用[2]。土壤酶是存在于土壤中的生物催化剂,土壤中所进行的一切生物化学过程都要经过酶的催化才能完成。土壤酶活性不仅是土壤理化性质的具体反应,而且还是土壤生物活性的重要体现。由于土壤酶的种类繁多,其单一酶活性也只能够反应土壤中某种特定生物化学及养分循环的过程[3]。一般情况下,土壤各养分含量与土壤酶活性之间有较好的相关关系[4]。脲酶作用是极为专性的,它能水解土壤中的尿素,生成氨、二氧化碳和水。土壤脲酶活泩的测定方法较多[5],常用的方法有比色法、扩散法和电极法等。邱莉萍等[6]研究表明,土壤中脲酶与磷酸酶活性的大小受土壤的理化性质和其他酶活性的影响。近年来,随着土壤酶活性研究方法及技术的不断更新,加之与其他学科的交叉与整合,不少学者发现,土壤酶具有评价土壤肥力[7]、诊断土壤污染[8]、评价土壤质量[9]、培肥土壤[10]及防治植物病虫害[11]等方面的功能。土壤脲酶活性可以表征土壤氮素的状况,通过测定各时期脲酶活性的变化,研究短密木霉、大豆与咪唑乙烟酸与脲酶之间的相关性,为咪唑乙烟酸的酶促降解提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

盆栽模拟试验土壤为m(草炭)∶m(沙子)∶m(土)=5∶3∶2的比例进行混合所得。大豆品种是黑农48,菌种是试验前期驯化得到的高效降解菌株短密木霉(Trichodermabrevicompactum)。

培养真菌的培养基采用孟加拉红培养基:蛋白胨5.0 g、葡萄糖10.0 g、磷酸二氢钾1.0 g、硫酸镁0.5 g、琼脂20.0 g、1/3 000孟加拉红溶液100 mL、蒸馏水1 000 mL、氯霉素0.1 g。

保存菌株采用PDA培养基:马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂15~20 g,蒸馏水1 000 mL。

1.2 试验方法

将短密木霉接种于60个PDA平板中,放入培养箱,25 ℃、黑暗条件下培养5 d。待菌株大量产孢后,将菌丝连同孢子刮下,加入到盛有无菌水的烧杯中,放入少量的吐温80,用玻璃棒充分的搅拌,均匀地混入部分试验用土壤中。再将部分试验用土壤加入不等量的5%咪唑乙烟酸水剂,分别制成咪唑乙烟酸质量分数为50、100、150 mg·kg-1的污染土。选择籽粒饱满、均匀、无病虫的大豆种子,每盆摆15粒,覆土2.0 cm,放在盆栽内自然生长。

按表1设计盆栽试验,每个试验组设置3个重复,种植于东北林业大学温室大棚中。盆栽处理后5、10、20、30、40 d分别用五点法取土样,风干,过10目筛,放入冰箱4 ℃保存待用。

表1 盆栽试验处理组合

1.3 土壤脲酶活性测定方法

采用苯酚钠-次氯酸钠比色法[12]测定土壤脲酶活性。脲酶活性以24 h后1.0 g土壤中NH3-N的毫克数表示。

m(NH3-N)=2a。

(1)

式中:a为从标准曲线查得的NH3-N质量(mg);2为换算成1.0 g土的系数。

每处理组设3组重复,并设无土对照和无基质对照组。

标准曲线的制作:在测定样品吸光值之前,分别取0、1、3、5、7、9、11、13 mL氮工作液,移于50 mL容量瓶中,然后补加蒸馏水至20 mL,再加入4 mL苯酚钠溶液和3 mL次氯酸钠溶液,随加随摇匀。20 min后显色,定容。1 h内在分光光度计上于578 nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标准曲线。

比色法测定土壤脲酶活性标准曲线

y=0.038 4x-0.003 9(R2=0.997 9)。

(2)

式中:x为氮工作液浓度,y为吸光度。

脲酶抑制(激活)率=((d-c)/c)×100%。

(3)

式中:c为空白对照处理的脲酶活性;d为农药处理的脲酶活性。

1.4 数据分析

原始数据的整理采用Excel软件完成;差异显著性测验采用SPSS16.0统计软件完成。

2 结果与分析

2.1 短密木霉对土壤脲酶活性的影响

由表2可知,在土壤中加入短密木霉后,土壤脲酶活性呈现出抑制—恢复—激活的趋势。在培养期间,A5与CK的脲酶活性差异性显著(P<0.05)。土壤脲酶活性5 d时有所下降,但从10 d起有显著的激活趋势,20 d时基本恢复到对照水平。脲酶活性到30 d后呈现激活状态直到试验结束。脲酶活性是表征土壤供氮能力的重要指标。处理30 d土壤氮素水平最高,激活率最高,达到31.13%。这可能是由于土壤中微生物死亡,细胞中的脲酶被释放到土壤中,增强了土壤脲酶的活性。

表2 不同处理对土壤脲酶活性的影响

注:表中数据为平均值±标准差;采用邓肯氏多重比较试验分析,同列数据后不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)。

2.2 种植大豆对土壤脲酶活性的影响

由表2得知,种植大豆后,土壤脲酶活性呈现出抑制—恢复—激活的趋势。在培养期间,A4组与CK对照组的脲酶活性均差异性显著(P<0.05)。种植大豆5 d时抑制率达到最高,为10.35%,10~20 d逐渐恢复到对照组水平。30 d后土壤脲酶活性被激活,直到试验结束,有明显的差异性。

2.3 咪唑乙烟酸对土壤脲酶活性的影响

由表2可知,当土壤中咪唑乙烟酸的质量分数分别为50、100、150 mg·kg-1时,土壤脲酶活性呈现出抑制—激活的趋势,土壤中脲酶活性随着咪唑乙烟酸质量分数的升高抑制率也在逐渐升高,在5~10 d脲酶活性被显著抑制,A8组10 d抑制率最高,为16.18%。30 d后呈现激活效应并持续到试验结束,在30 d时A7组激活率最高,达到85.23%;除A8组10 d脲酶活性外,其他脲酶活性均与CK对照组有明显的差异性。

2.4 协同作用对土壤脲酶活性的影响

由表2可知,在土壤中种植大豆、加入短密木霉之后,再分别加入50、100、150 mg·kg-1的咪唑乙烟酸,土壤脲酶基本呈现抑制—恢复—抑制—激活的趋势。5 d时加入50 mg·kg-1的A1组脲酶抑制率最高,达到38.42%,10 d逐渐恢复到水平对照,30 d后呈现激活状态一直到试验结束。30 d激活率最高,达到29.29%。在加入50、100 mg·kg-1咪唑乙烟酸的对照组中,5 d时脲酶活性被抑制。而加入150 mg·kg-1的处理组却与对照组基本持平,不加短密木霉的土壤脲酶活性变化很大,而种植大豆后的土壤脲酶活性基本无变化,这可能与大豆的固氮作用有关。短密木霉对咪唑乙烟酸有一定的降解作用,在土壤中同时加入二者后,相当于模拟了大豆田的基本模式,咪唑乙烟酸的质量分数越高,脲酶受到的抑制作用也就越强,但当咪唑乙烟酸质量分数为150 mg·kg-1时,土壤脲酶的活性却高于在土壤中加入100 mg·kg-1的咪唑乙烟酸,可能是由于咪唑乙烟酸的淋溶作用。脲酶是对尿素转化起关键作用的酶类,脲酶活性越低,说明这时土壤中的供氮能力越弱。

3 结论与讨论

本研究表明:当土壤中咪唑乙烟酸的质量分数分别为50、100、150 mg·kg-1时,5~10 d脲酶活性被抑制,20~40 d时又被激活,该结果与张清明等[13]报道的氟磺胺醚100、500 μg·kg-1的处理对土壤脲酶的作用趋势一致。在种植大豆后,加入50、100 mg·kg-1的咪唑乙烟酸的A1、A2组呈现抑制—激活—抑制的趋势,该结果与王鑫宏等[14]报道的氯嘧磺隆在土壤中质量分数为12~48 μg·g-1时对土壤脲酶的影响结果一致。咪唑乙烟酸属咪唑啉酮类除草剂即支链氨基酸生物合成抑制剂,大豆可将其代谢,所以种植大豆后并加入咪唑乙烟酸的脲酶活性要比未种植大豆的高,也说明咪唑乙烟酸对脲酶在一定程度上有抑制作用。脲酶活性是表征土壤供氮能力的重要指标。在土壤中加入短密木霉后,30 d土壤脲酶活性最高,土壤氮素水平最高,有可能由于土壤中微生物死亡,细胞中的脲酶被释放到土壤中,增强了土壤脲酶的活性。大豆的生长随着咪唑乙烟酸添加的毫克数的增加,受到的抑制力就越大。

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