复苏周期囊胚移植后完全性葡萄胎与正常胎儿共存病例分析

邵淑敏，李姣，邹敏，汪文诤，张玲

(华中科技大学同济医学院生殖医学中心/计划生育研究所，武汉 430030)

患者，女，31岁，因“女方继发性不孕，男方梗阻性无精子症，双侧输精管缺如”在本生殖中心行ICSI-ET助孕治疗。女方身高158 cm，体重62.6 kg，BMI 25.08 kg/m2，无不良嗜好，健康状况良好，无既往病史，无家族病史。平素月经规律，11岁，5～7 d/30～37 d，经量中等，无痛经。女方初婚足月产一子，现健在。2011年再婚后一直同居，有正常性生活，未避孕三年未孕，无流产和早产史。女方基础内分泌FSH 5.56 U/L、LH 2.98 U/L、E2102.76 pmol/L，窦卵泡计数(AFC)27 个，血型B/Rh阳性，染色体组型46,XX，其他检查未见明显异常。男方，28岁，一般体格检查正常，无既往病史，无家族病史。生殖系统检查睾丸体积正常，左右输精管扪及不清，其他无异常。男方基础内分泌FSH 3.95 U/L、LH 3.69 U/L、E232.00 pmol/L、PRL 5 634.11 mU/L、T 10.96 nmol/L。多次精液常规检查均未见精子，行双侧睾丸穿刺术可见精子，无任何不适症状。血型B/Rh阳性，染色体组型46，XY。

女方促排卵采用长方案，月经周期第21天开始皮下注射GnRH-a(达菲林，辉凌，美国)0.1 mg/d，持续皮下注射14 d后，注射剂量调整为0.05 mg/d，持续皮下注射3 d后通过B超检测达到降调效果，肌肉注射FSH(普丽康，默沙东，英国)200 U/d启动Gn，启动Gn后持续皮下注射GnRH-a 0.05 mg/d；Gn启动第3 天开始B超检测卵泡发育，Gn启动第7 天，调整FSH的肌注量为100 U/d，并增加肌注75 U/d HMG(珠海丽珠)，Gn启动第9 天，Gn总量为1 700 U，其中FSH 1 400 U、HMG 300 U，B超显示获得18～20 mm以上的优势卵泡5 个，血激素水平LH 2.46 U/L、E219 003.26 pmol/L、P 3.02 nmol/L，内膜厚度9 mm，内膜类型为A型，当晚20：00点肌肉注射10 000 U HCG(珠海丽珠)，HCG肌肉注射后36～37 h在阴道B超引导下取卵，获取23 个卵母细胞，并将卵母细胞置于受精培养液中(G-IVF PLUS，Vitrolife，美国)暂时培养。

男方于取卵日行睾丸穿刺术获取精子，用20 ml注射器针头抽吸睾丸组织，并置于盛有精子洗涤液(SpermRinse，Vitrolife，美国)的培养皿中，用针头将组织撕碎，倒置显微镜下检查有无精子，每高倍镜视野下偶见精子，未见活动精子，精子形态正常。将撕碎的睾丸组织350g离心10 min，弃上清，在沉淀上加0.2 ml精子洗涤液(SpermRinse)，获得的精子置于室温下待用。卵母细胞暂时培养2 h后，用透明质酸酶(Sigma，美国)消化法脱去卵周围大部分颗粒细胞，观察卵母细胞的成熟度。22 个MⅡ卵行ICSI，胚胎培养第1 天观察受精情况，10 个正常受精卵(2PN)、4个异常受精卵(1PN)、8个未受精卵(0PN)；胚胎培养第3 天共获得9 个优质胚胎，移植2 个胚胎(评分为8Ⅱ、8Ⅱ)，冷冻6 个卵裂期胚胎。正常受精剩余2 个和1PN来源4 个胚胎行囊胚培养，胚胎培养第6 天，2个1PN来源的卵裂期胚胎形成2 个优质囊胚行冷冻保存(评分为4CB、4CB)。胚胎移植术后常规用药，胚胎移植术后14 d测定血清中尿β-HCG值为1.63 U/L，未妊娠。

2015年5月行人工周期冻融胚胎移植(FET-ET)，从月经周期第2 天开始口服补佳乐(拜耳，德国)4 mg/d，月经周期第12 天左侧卵巢有1个0.8 cm×0.7 cm卵泡，内膜厚度为5.5 mm，根据内膜情况和血激素水平调整补佳乐剂量为6 mg/d，月经周期第16 天调整补佳乐剂量为8 mg/d，并监测LH峰，月经周期第19天，补佳乐使用天数18天，总量96 mg，内膜厚度为7 mm，肌肉注射黄体酮(珠海丽珠)40 mg进行内膜转化，内膜转化第6天移植2 个4CB囊胚(1PN来源)。移植后肌肉注射黄体酮60 mg/d，补佳乐维持原剂量。移植后14 d测定β-HCG值为1 358 U/L。移植后28 d，B超显示：宫内单活胎早孕，囊内可见卵黄囊，胚芽可探及和原始心管搏动血流信号；另可见一无回声区，内未见明显卵黄囊，孕囊周边可见非纯液性暗区。移植后34 d，患者阴道间断流血入院保胎治疗，渐出现恶心、呕吐，伴腹胀，并逐渐加剧。2015年7月复查三维彩超显示：宫腔右侧可见一成形胎儿，可见胎动及胎心搏动；宫腔左侧可见12 cm×6.8 cm高回声光团，内可见蜂窝状大小不等的无回声，边界清晰，光团周边可见丰富的血流信号。超声提示：单胎存活合并葡萄胎，卵巢黄素囊肿。患者腹胀加剧，呼吸困难，血压持续增高，转入上级医院治疗。转院后查血β-HCG>1×106U/L；B超：宫腔内见一成形胎儿，可探及胎心；宫腔左侧见不均匀增高区，内在散在无回声区，呈蜂窝状。CT：两侧胸腔积液、纵隔内，两侧腋窝多发淋巴结显示。孕11+5周确诊为宫内早孕合并滋养层细胞疾病，并给予对症治疗，行葡萄胎负压吸宫术+钳刮术。病理组织提示：见滋养层细胞增生，绒毛间质高度水肿，间质内无胎源性血管，为完全性葡萄胎。术后第2 天开始第1 个疗程化疗，连续化疗4 个疗程，术后2个月β-HCG降至正常，继续巩固化疗3 个疗程，至今未复发。

讨 论

根据细胞遗传学分类，将葡萄胎分为部分性葡萄胎(PHM)和完全性葡萄胎(CHM)，PHM是由一个单倍体卵母细胞和两个单倍体精子受精，或由一个单倍体卵母细胞和一个减数分裂缺陷的双倍体精子受精而成，其染色体核型90%以上为三倍体，合并存在的胎儿也是三倍体，通常三倍体的胎儿在孕期前3 个月就不能存活。CHM是由一个细胞核缺如或失活的卵母细胞与一个单倍体精子受精，或有一个失活的卵母细胞分别和两个单倍体精子同时受精而成，其染色体核型为二倍体，均为父本来源，不能形成胎儿[1]。在临床上，完全性葡萄胎与胎儿共存(CHMCF)的发生率为1/22 000～1/1 000 000，其胎儿有可能继续存活，但是易出现流产、早产、产前子痫等并发症[2]，其真正的发病原因目前尚不清楚，促排卵或医源性多胎是否造成CHMCF发病率增加，目前也尚无定论。

多篇文献报道ART治疗后发生妊娠滋养细胞疾病，均为个案报告，主要是集中在IVF/ICSI-ET后，可能与精子/卵母细胞异常、促排卵刺激、负压抽吸取卵、胚胎质量、技术操作、体外培养等因素有关[3]。个别文献报道是使用促排药之后，研究发现79%的多胎合并CHM患者曾服用促排卵药物，这可能与促排卵药物增加异常卵母细胞发生率有关[4]。在本病例中，移植的2 枚囊胚均来源于ICSI的1PN胚胎。ICSI受精是将单个精子注射入卵胞质内，受精16～18 h后，卵母细胞内出现2 个原核(2PN)，并且卵周间隙内有2 个极体，被认为正常受精；但仍有一部分卵母细胞出现1 个原核(1PN)和多个原核(≥3PN)，则被认为是异常受精。ICSI的异常受精可能与卵母细胞质量差、精子缺陷等有关；对于含有2个极体但只有1PN的合子，可能是极体碎片化造成的误判，ICSI前对卵母细胞进行脱颗粒细胞时就已经形成了极体的碎片化，且这种卵母细胞受精后也不能形成雌原核或雄原核[5]。研究表明，IVF受精形成的1PN受精卵通常是二倍体的，且50%含有Y染色体[6]，1PN来源的囊胚仍可以保持足够的维持妊娠率；但ICSI中1PN来源的囊胚则不能维持妊娠[7]。研究发现ICSI受精形成的1PN受精卵，仅有10%含有Y染色体，说明来源于ICSI受精的1PN合子可能不是精卵受精形成的，但其形成机制目前尚不清楚。有研究认为可能是在细胞分裂中期，通过电融合细胞核的方式成为一个完整的合子，进而形成一个单倍体胚胎，通常与延迟排卵和卵母细胞过熟等因素有关[6]。但也有研究持相反的理论，认为来源于ICSI的1PN胚胎中有27.9%是具有雌原核和雄原核的二倍体的胚胎，ICSI受精后8～10 h可观察到原核发育不同步的现象，认为1PN合子是由于原核观察时两个雌、雄原核发育速度不同步或过早融合造成的。同时，ICSI中1PN合子形成的卵裂期胚胎的单倍体发生率明显高于IVF(31.2% vs 3.1%)，且所有的卵裂球均只检测到Y染色体，认为雄原核激活、雌性基因组完全被排除与单原核形成有关[8]。但有研究则认为ICSI的1PN合子的单个原核携带母源和父源的两套基因组，是在受精过程中原核形成失调引起的[9]。

正常受精和异常受精卵裂形成的胚胎都可能存在染色体异常，尤其是异常受精的胚胎，非整倍体和嵌合体的发生率较高，胎儿畸形和葡萄胎的出现明显增多[10]。ICSI来源的1PN胚胎存在染色体异常，约占70%[8]，也有研究指出ICSI来源的1PN胚胎均为染色体异常的胚胎，因此葡萄胎可能来源于ICSI的1PN胚胎。近年来有多个研究报道ICSI后发生葡萄胎妊娠的病例，与本病例相同的文献报道指出移植2 个ICSI胚胎(2PN和1PN胚胎各1 个)后形成葡萄胎和正常胎儿共存，推断1PN来源的异常受精胚胎是造成葡萄胎的原因，认为移植1PN来源的胚胎有一定的风险[11]。但有文献报道移植3 个ICSI的2PN胚胎，也形成CHM和正常胎儿共存的双胎妊娠，且遗传分析发现CHM的基因组来源于一条单个精子的重复，二倍体精子受精或精子DNA核内再复制是引起葡萄胎妊娠的原因[12-13]。在 ICSI胚胎形成的葡萄胎组织中，检测到父源二倍体基因组，认为可能是由于单倍体父源基因组再复制后和一个失活的卵母细胞受精，或者是二倍体精子和一个失活的卵母细胞受精造成的[14]。此外，移植ICSI后的第3天冻融胚胎也有形成PHM的病例报道。ICSI-ET后形成葡萄胎的染色体均为父源性，没有母源性染色体，是精子DNA核内再复制成二倍体或二倍体精子受精等引起的，因此ICSI技术的单个精子受精并不能完全防止葡萄胎妊娠的发生，ICSI技术操作的精子选择或机械损伤对ART葡萄胎形成的潜在影响还需进一步探讨[15]。

来源于ICSI的1PN合子可能是受精过程中原核形成异常造成的，引起第一次有丝分裂和染色体分离异常，导致形成染色体异常的胚胎。ICSI来源的1PN胚胎染色体异常比例较高，染色体正常率仅约为25%。虽然文献报道染色体异常比例结果不一致，但大部分研究认为囊胚培养可筛选一部分较强发育潜能和染色体正常的胚胎，提高胚胎利用率和累积妊娠率。此外，1PN胚胎也有可能是原核发育不同步或过早融合造成的，若1PN卵裂期胚胎能形成囊胚，则可认为其染色体正常的机率较高，可用于冷冻和移植。本例患者移植1PN囊胚后形成葡萄胎，相似临床病例认为1PN胚胎有可能与葡萄胎形成有关，75%的染色体异常的胚胎也能形成质量较好的囊胚，囊胚培养并不能筛除染色体异常的胚胎，为提高辅助生殖技术的安全性，对于ICSI后形成的1PN胚胎应予以废弃[9]。同时，本文认为IVF来源的1PN胚胎也不应该作为首选的移植胚胎，若需移植1PN胚胎，可以通过植入前遗传学筛查排除染色体异常后再行移植。