斑马鱼毒性测定在实验教学中的应用

吴李娜 郭春丽 孙薇薇 李晓玲 龙腾腾 岳 旺 张继国

(1.青岛黄海学院，山东 青岛 266427； 2.青岛市立医院，山东 青岛 266001； 3.泰山医学院，山东 泰安 271016)

医药实验教学多用哺乳动物小鼠测定毒性，存在成本高、饲养困难、易被咬伤和伦理等问题。斑马鱼(Zebrafish)可用于急性毒性测定研究，是一种可替代小鼠有前途的新型脊椎动物模型，国内外已有报道[1-2]斑马鱼也可用作神经病学抗癫痫动物模型[3]。本研究用斑马鱼及小鼠进行烟雾水溶液急性毒性测定，观察烟雾水溶液对斑马鱼和小鼠行为及死亡率的影响，探讨斑马鱼作为毒性监测和教学实验动物的实用价值。

1 材料与方法

1.1材料与动物

成年斑马鱼15条，雌雄兼用，购自青岛观赏鱼市场，体长(31±4)mm，体质量(240±20 mg)，水族箱中驯养3 d以上，正常喂食，每天2次，正式实验前24 h禁食。室温与水温控制在(24±2)℃，昼夜自然照明，均于上午9:00开始。

成年昆明种小鼠9只，雌雄兼用，由青岛市实验动物中心提供，体质量(24±2)g。正常饮食，室温(24±2)℃，正式实验前禁食24 h。昼夜自然照明，均于上午9:00开始。

实验用圆柱形水族箱，直径20 cm，高15 cm，市场购得；便携式玻璃水烟壶，8 cm×6 cm×10 cm，购自温州亨达烟具厂；实验用水为市售矿泉水；香烟为泰山牌过滤嘴香烟，市场购得，焦油量12 mg，烟气烟碱量1.2 mg，烟气一氧化碳量13 mg。

1.2实验方法

1.2.1烟雾水溶物对斑马鱼急性毒性试验

实验分3组：空白对照组、烟雾水溶液高剂量组、烟雾水溶液低剂量组。实验用水烟壶实验前均依次用等量洗涤剂、自来水、KMnO4溶液、矿泉水进行冲洗，各加入10 ml矿泉水。高剂量组将香烟滤嘴端插入带有过滤装置的水烟壶中，点燃香烟由一名志愿者缓慢匀速抽吸，使烟雾以小泡状通过矿泉水，至2支香烟燃毕，制备香烟烟雾水溶液。低剂量组将制备的香烟烟雾水溶液稀释1倍。每组溶液中投放5条斑马鱼。观察1、2、3、5、10内斑马鱼的游速、侧翻等行动变化及死亡等情况。

1.2.2烟雾水溶物对小鼠急性毒性试验

选出志愿吸烟同学，吸烟前先将4 ml矿泉水放入清洗过的水烟壶内振摇，用注射器抽取1 ml作为对照试验。将香烟插入水烟壶上，点燃香烟吸入，边吸边晃动，使烟雾融入液体中，此时，烟内的毒物如烟碱等即融入水中。抽完2支烟后，用其含烟碱水溶液给小白鼠行腹腔注射(ip)。

取小鼠9只，随机分为3组，每组3只。对照组吸烟前水烟斗内液体0.5 ml，ip作为对照；低剂量组吸烟后水烟斗内液体0.25 ml+0.25 ml矿泉水，ip；高剂量组注射同样液体0.5 ml，ip(注射容积均为0.5 ml/只)。观察10 min内各鼠竖尾程度、活动频率、角弓反张等行为变化及死亡等情况。

2 结 果

2.1烟雾水溶液对斑马鱼急性毒性症状

在急性毒性试验中，实验组斑马鱼1 min内不停快速游动且速度不均匀，2 min开始侧翻、打转，3 min出现游动迟缓，5 min出现死亡情况，低剂量在10 min内全部死亡，且与剂量成正相关性；空白对照组5条斑马鱼活动情况无明显改变，均匀游动或静止，无死亡现象(表1)。

2.2香烟烟雾水溶液对小鼠急性毒性症状

空白对照组小鼠注射矿泉水后行为均无明显改变；实验组小鼠注射香烟烟雾水溶物后在2 min内可观察到竖尾、呼吸困难、全身剧烈抽搐等现象，5～10 min内高剂量组均死亡，且与剂量成正相关(表2)。

表2 香烟烟雾水溶液对小鼠行为的影响(n=3)

3 讨 论

实验动物是生命科学研究和教学实验的载体，所选动物其基因应接近人类。毒性测定是高校药理学必修实验，各种药物的毒性测定，如急性毒性、亚急性和慢性、半数致死量测定等，多选用哺乳动物小鼠，但其实验存在周期长、用药量大、费用高、饲养困难及动物福利和伦理等问题。操作简单、成本低廉、测试周期较短的模式动物广泛用于毒性检测和评价。斑马鱼与人类基因相似度达87%，是国际标准化组织(ISO)推荐使用的实验模式动物[4]。与其他脊椎动物(如哺乳动物小鼠)相比，斑马鱼具有个体小、便于获得、养殖条件简单、繁殖速度快、生命周期短、生长迅速、实验费用低等优点，已成为生命科学研究领域的热点模式生物。鱼类对水体中的毒物较为敏感，直接由鳃组织吸收和滞留污染物和毒物，在水体、空气、食品等毒性监测中应用广泛[5-6]。在毒性监测方面，我国古代先民早有在水缸中放入鱼类检测毒性的智慧。

斑马鱼和其它鱼类均可用于毒性测定[7]。本实验测定斑马鱼对烟雾水溶液的急性毒性反应，并与小鼠急性毒性测定做比较。实验中将斑马鱼置于不同浓度的烟雾水溶液中，相当于模拟人类在短时间内大剂量吸入香烟的情况，用等容量的矿泉水做空白对照，同时测定烟雾水溶液对小鼠的急性毒性。

该实验结果与烟雾水溶液对小鼠的急性毒性影响基本一致，证明斑马鱼同样具备实验作用，安全有效，为一种良好的实验动物模型，斑马鱼体型小，易携带，为制造便携式毒性检测装置打下了基础，适于学生实验课程，为实验教学改革提供了新思路。

[1] Vittozzi L, Angelis GD. A critical review of comparative acute toxicity data on freshwater fish[J].Aquatic Toxicology,1991,19(91):167-204.

[2] 贾顺姬,孟安明.中国斑马鱼研究发展历程及现状[J].遗传,2012,34(9):1082-1088.

[3] 岳旺,张继国,杨杰,等.斑马鱼—一种新型电惊厥动物模型[J].神经药理学报, 2014, 4(6):17-20.

[4] Tsang M．Zebrafish: a tool for chemical screens[J].Birth Defects Research Part C: Embryo Today:Reviews,2010,90(3):185-192.

[5] 张述智, 张述仁,岳旺,等. 一种便携式粮果蔬及水质毒性生物检测装置[P].ZL201510219269.3.

[6] 姜剑,岳川,岳旺,等.一种便携式空气毒性生物检测装置[P].ZL 201520276573.7.

[7] 熊婷, 霍文冕, 窦立宝,等. 香烟烟雾水溶液对小草鱼急性毒性试验的研究[J]. 环境监测管理与技术, 2010,22(4):27-29.