儿茶素EGCG联合伐地那非抑制口腔癌细胞体外增殖的研究

张 晨 倪成励 陶 冶

(安徽医学高等专科学校口腔系，安徽 合肥 230601)

研究显示儿茶素具有消炎、抗肿瘤、降血脂、降血压等多种药理功能。日本学者在二十世纪八十年代报道了EGCG(Epigallocat-echin-3-gallate)能够抑制人体癌细胞以来，诸多学者对儿茶素的抗癌作用进行了深入研究[1]。张勇等[2]从遗传毒性、短期毒性、皮肤毒性、急性毒性、生殖毒性以及致畸性等方面对EGCG的安全性进行了系统的研究。EGCG具有较强的抗癌作用和安全性已经被诸多学者的研究证实，提高了临床癌症患者的存活期和治疗效果。儿茶素EGCG已经作为临床抗癌药物的新途径，但其也不可避免地陷入癌症治疗中多药耐药(multidrug resistance，MDR)困境[3]，即肿瘤细胞长期接触某种化疗药物之后对此药物产生了耐药性，而且可对其他结构和作用机制不同的多种化疗药物产生交叉耐药性。研究发现伐地那非能够逆转P-gp蛋白介导的MDR，并且低毒高效，其联合化疗药物使用能够抑制肿瘤细胞的增殖，并且避免和降低了药物的不良反应[4]。本研究观察EGCG联合伐地那非对人体外培养的CAL-27、SCC-25以及KB细胞增殖的影响，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 体外培养人CAL-27、SCC-25以及KB细胞株。人类上皮细胞癌细胞系为CAL-27，5%CO2，37 ℃条件下，在100 U/ml的青霉素或链霉素和10%的胎牛血清的培养液中培养。同时将100 U/ml的青霉素或链霉素和10%的胎牛血清按照1∶1的比例混合培养SCC-25和KB细胞株，培养条件与上述细胞株相同。2～3 d传代一次，取对数生长期细胞。

1.2药物配制 按照相关文献的研究成果[5-7]，EGCG溶液浓度配制为50 μg/ml，具体方法为：将EGCG溶解在蒸馏水中，室温下搅拌1 min，然后用5000 r/min的离心机离心10 min，静置5 min后取上清液，使用过滤器过滤，从而达到灭菌的目的。伐地那非溶液的配制方法与EGCG溶液类似，分别配制成0，2.5，5，10，20 μmol/L 5个浓度梯次的伐地那非溶液，其中0 μmol/L为对照。将5个梯度的伐地那非与EGCG混合摇匀，编为A1组、A2组、A3组、A4组和A5组。根据此阶段研究结果，以5 μmol/L的伐地那非浓度为基础，分别与浓度为50，60，70，80，100 μg/ml的EGCC溶液混合，观察不同剂量EGCC联合伐地那非抑制CAL-27、SCC-25以及KB细胞株增殖的剂量效应和时间效应。

1.3方法 本研究采取MTT方法测定抑制作用，细胞培养利用培养板中放入的对数生长期的细胞，在适宜条件下培养24 h后放入5组溶液中联合培养。测定时使用PBS缓冲液冲洗2次后，加入一定量的冷乙醇固定0.5 h，最后离心染色，用FCM检测抑制率。KB细胞则用0.25%胰酶消化，然后5000 r/min离心，使用缓冲液调整细胞密度(1.0×107个/ml)，选取50只裸鼠，抽取0.2 ml细胞液接种到裸鼠背部皮下，然后观察癌细胞瘤体积和质量。

2 结 果

2.1不同浓度组合的EGCG联合伐地那非对鳞癌细胞株的抑制作用 通过上述实验过程，采用不同浓度组合的EGCG联合伐地那非A1组、A2组、A3组、A4组和A5组均有抑制效果，随着伐地那非浓度的升高，两种药物联合的抑制作用更强，EGCG联合伐地那非比单独使用EGCG对鳞癌细胞株的抑制率差异显著(F=32.283，P=0.000)。研究还发现，A4组中，EGCG联合10 μmol/L的伐地那非对CAL-27、SCC-25、KB细胞株的抑制率分别为81.28%、85.23%、55.46%，A4与A5相比，差异无统计学意义(P>0.05)，表明随着伐地那非浓度的持续升高，会达到协同作用的阈值。

表1 EGCG联合不同浓度伐地那非对鳞癌细胞株的抑制率(%)

注：组间方差结果：F=32.283，P=0.000。

2.2EGCG联合伐地那非对裸鼠移植瘤生长的影响 从表2中可以看出，A1裸鼠中癌移植瘤体积最大，瘤重最重，A5裸鼠中癌移植瘤体积最小，瘤重最轻。其他4组与A1组相比，均显著低于其瘤体积和瘤重，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2 EGCG联合伐地那非对裸鼠移植瘤生长的影响

注：*与A1组相比，P<0.05。

2.3不同浓度EGCC联合5 μmol/L的伐地那非抑制口腔癌细胞增殖的时间和剂量效应 根据前研究结果，5 μmol/L伐地那非联合不同浓度EGCC的细胞抑制率的剂量效应和时间效应，每个浓度梯度设计6个平行组，从表3和表4结果中可以看出，口腔癌细胞CAL-27、SCC-25、KB细胞株对不同浓度的EGCC呈现出剂量的依赖效应，低浓度的EGCC联合伐地那非与高浓度的EGCC联合伐地那非相比，口腔癌3种细胞株差异均有统计学意义(P<0.05)。从时间效应分析，5 μmol/L的伐地那非联合80 g/ml EGCC对口腔癌细胞的增殖呈现时间依赖的抑制效应。且作用时间越长，抑制作用越明显。

表3 不同浓度EGCC联合5 μmol/L的伐地那非抑制口腔癌细胞增殖的剂量效应

表4 5 μmol/L的伐地那非联合80 g/ml EGCC抑制口腔癌细胞的时间效应

3 讨 论

社会经济的进步，人们的生活方式和饮食习惯等均随之改变，由此引发的口腔癌呈现递增且年轻化的趋势，罹患口腔癌严重影响患者的生活质量，因口腔癌的特殊性使得临床上通常采用保守的口服化疗药物的治疗方式，由于化疗对患者身心健康的摧残十分严重，且化疗药物的不良反应非常影响患者依从性，从而使得临床上对低毒高效化疗药物的应用十分迫切[8]。儿茶素中的活性成分是EGCG，研究发现儿茶素EGCG具有非常高效的抗癌作用，且由于EGCG是天然提取物，对患者的毒副作用比较低，由此成为非常理想的化疗药物。基于儿茶素EGCG的特性，诸多研究者对其抗癌机制展开了深入的研究，从诱导细胞凋亡到与细胞凋亡有关的酶类包括其信号传导通路的研究均有研究成果[9-10]。同时，在口腔癌的化疗中，MDR也是影响肿瘤患者化疗成功的重要因素，有研究表明伐地那非及其同系物能够成功逆转癌细胞对多种抗癌药物的耐药性[11]。另外，EGCG联合伐地那非抗癌机制主要在于EGCG的抗癌高效性和伐地那非能够逆转癌细胞对包括EGCG在内的多种抗癌药物的耐药性，使得抗癌药物能够高效地表达并发挥作用。

本研究结果表明，EGCG联合20 μmol/L的伐地那非对CAL-27、SCC-25、KB细胞株的抑制率分别为83.27%、86.27%、60.23%，而单纯使用EGCG对三种细胞株的抑制率分别为40.02%、18.86%、11.27%，随着伐地那非浓度的升高，两种药物联合的抑制作用更强，与对照组相比，EGCG联合伐地那非比单独使用EGCG对鳞癌细胞株的抑制率差异显著(P<0.05)，A4与A5相比，差异无统计学意义(P>0.05)。A1组癌移植瘤体积为(1.56±0.36)cm3，瘤重(0.76±0.22)g，A5组癌移植瘤体积为(0.85±0.16)cm3，瘤重(0.32±0.11)g，A1裸鼠中癌移植瘤体积最大，瘤重最重，A5裸鼠中癌移植瘤体积最小，瘤重最轻。其它四组与A1组相比，均显著低于其瘤体积和瘤重，差异具有统计学意义(P<0.05)。口腔癌细胞CAL-27、SCC-25、KB细胞株对不同浓度的EGCC呈现出剂量的依赖效应，低浓度的EGCC联合伐地那非与高浓度的EGCC联合伐地那非相比，口腔癌三种细胞株差异均达到显著(P<0.05)。从时间效应分析，5μmol/L的伐地那非联合80 μg/mLEGCC口腔癌细胞增殖呈现时间依赖的抑制效应。且作用时间越长，抑制作用越明显。

本研究结果与国内外相关研究成果结论相似，具有一定的研究价值[12]。EGCG作为天然提取物，其不良反应较低，联合伐地那非对MDR的逆转作用，具有相当的抗癌潜力，值得进一步探索。

[1] Fujiki H，Suganuma M，Okabe S，et al.Cancer inhibition by green tea[J].Mutat Res-Fund Mol M，1998，402(1/2):307.

[2] 张勇，沈筱芸，冯雁，等.EGCG对人肝癌细胞的抑制作用及其可能的机制[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2014，21(l):38-43.

[3] 朱晋首，金青哲，张士康，等.脂溶性儿茶素类化合物的制备研究进展[J].中国茶叶加工，2012，(1):43-47

[4] 朱媛，张雪松，黄小忠.脂溶性茶多酚制备工艺的研究[J].中国粮油学报，20 14，29(6):74-78，92

[5] Detwiler A，Bloom P，Petersen A，et al.Multi-drug and nletliicillin resistance of stapliylococci flom canine patients at a veterinary teaclling hospital(2006-2011)[J].vet Q，2013，32(2):60-67.

[6] 陈一天，封冰，陈龙邦.小细胞肺癌化疗耐药研究进展[J].医学研究生学报，2012，25(5):515-19.

[7] 王水明，金黑鹰，张春霞，等.表没食子儿茶素没食子酸酯对结肠癌皮下易位的原位荧光动物模型肿瘤生长和转移的作用[J].世界华人消化杂志，2010，18(28):3016-3019.

[8] 刘晓慧，揭国良，林康，等.EGCG和茶氨酸对细胞氧化损伤的的协同保护和修复作用研究[J].茶叶科学，2014，34(3):239-247

[9] 王川丕，诸力，周苏娟，等.儿茶素EGCG与其空间异构体GCG的抗氧化活性和反应活性的密度泛函理论研究[J].天然产物研究与开发，2015，(27):645-650.

[10] 昌丽静，王晶，王鹏程，等.酷化型表没食子儿茶素没食子酸酯对乳腺癌细胞凋亡的影响[J].中国生物制品学杂志，2014，27(6):764-769.

[11] 余盛富，李谨，朱普堂，等.EGCG协同塞来昔布抑制鼻咽癌细胞增殖和下调Cox-2表达[J].中国误诊学杂志，2010，10(28):6898-6899.

[12] 刘晓亮，袁长吉，庄平，等.EGCG对口腔鳞癌细胞增殖及信号传导通路的影响[J].华中科技大学学报:医学版，2013，42(5):530-534.