P2X4对帕金森病模型大鼠黑质中α突触核蛋白表达的影响

(青岛大学附属医院神经内科，山东 青岛 266100)

帕金森病(PD)是一种常见的神经退行性疾病，该病典型临床症状为静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势平衡障碍[1]。其病理特点是中脑多巴胺能神经元的丢失，以及α突触核蛋白(α-synuclein)为主要成分的路易小体的形成[2]。已有研究表明，炎症、线粒体功能障碍、氧化应激等参与了PD的发生发展过程[3-5]。这些为PD的治疗提供了新的靶点。

P2X4受体是一种三聚体的通道蛋白的嘌呤受体，在大脑、脊髓组织中均有广泛分布，P2X4受体在T淋巴细胞上也有表达，有促进T细胞活化及抗原呈递作用[6]。小胶质细胞被激活后可发挥巨噬细胞的功能，激活包括P2X4受体在内的多种受体，促进多种炎性因子释放，此过程参与了神经病理性疼痛、癫痫等多种神经系统疾病的发生、发展过程[7-8]。神经炎症是PD的重要发病机制之一，我们推断在PD的动物模型中P2X4参与了小胶质细胞的激活过程，从而介导PD的发病。本研究通过观察6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的PD模型大鼠黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性多巴胺能神经元数量以及测定P2X4、半胱氨酸蛋白水解酶1(caspase-1)、α-synuclein蛋白的表达水平，探讨P2X4对PD模型大鼠黑质中多巴胺能神经元的潜在影响。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

SPF级雄性Wistar大鼠120只(购于青岛市实验动物和动物实验中心)，体质量200～250 g，单笼饲养，置于(20±2)℃室温，大鼠自由饮水、摄食。将120只大鼠随机分为6组(每组20只)，分别为对照组(A组)、6-OHDA组(B组)、P2X4-NC组(C组)、siRNA-P2X4+6-OHDA组(D组)、siRNA-P2X4组(E组)、P2X4-NC+6-OHDA(F组)。大鼠完全适应实验室环境后可进行实验。

1.2 器材与试剂

冷冻切片机(Leica公司，德国)；脑立体定位仪(瑞沃德公司，中国)；荧光显微镜(Carl Zeiss公司，德国)；PCR仪(ABI，美国)；10 μL微量注射器(Stoelting，美国)；P2X4慢病毒(吉凯公司)；P2X4抗体(Alamnelabs，以色列)；caspase-1抗体(Abcam公司，英国)；α-synuclien抗体、GAPDH抗体(Cell Signaling Technology，美国)；TH抗体(Millipore，美国)；驴抗兔荧光二抗(Life Technologies，美国)；6-OHDA、阿扑吗啡(APO)(Sigma，美国)；SYBR Green荧光定量PCR试剂盒(Qiagen，德国)；逆转录试剂盒(Thermo，美国)；Trizol(Takara，日本)。

1.3 PD模型大鼠的制备

各组大鼠称体质量后，以100 g/L水合氯醛按400 mg/kg的剂量腹腔注射麻醉；备皮后将大鼠牢固固定在立体定位仪上，经碘附和乙醇消毒后，由头部的正中矢状位切开头皮，露出前囟。根据大鼠脑立体定位图谱[9]，定位左侧黑质(前囟后5.0 mm，中线左侧2.1 mm，深度7.7 mm)，用牙科钻在已定好位置钻孔，随后用微量注射器吸取0.3 μL阴性对照慢病毒或携带目的基因的慢病毒在大鼠左侧黑质处定位注射，针头滞留5 min后缓慢拔出。A组、B组、C组、E组分别通过立体定位仪用微量注射器向大鼠左侧黑质注射生理盐水、6-OHDA、携带空载siRNA的慢病毒、携带抑制P2X4表达的目的siRNA-P2X4慢病毒；D组、F组分别注射携带抑制P2X4表达的目的siRNA-P2X4慢病毒和携带空载siRNA的慢病毒，2周后进行6-OHDA(4 g/L)黑质内注射。

1.4 成模标准

完成上述实验操作后2周，脑内注射6-OHDA的大鼠向腹腔内注射浓度为0.5 g/L的APO，剂量为0.5 mg/kg，10 min后观察并记录大鼠旋转次数，观察60 min，平均转速>6 r/min为成功模型，否则为不成功模型。剔除死亡及造模失败的大鼠后，A、B、C组均剩余16只大鼠，D、E、F组均剩余15只大鼠。

1.5 Western blot法检测P2X4、caspase-1、α-synuclein蛋白的表达

将6组大鼠各取10只以100 g/L水合氯醛腹腔麻醉后断头取脑，取左侧黑质组织，分别置于EP管中，每个EP管内加入200 μL细胞裂解液(其中含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂)，研磨棒研磨组织，置于冰上裂解30 min后，置于低温离心机中(4 ℃条件下)12 000 r/min离心15 min后提取上清液，采用BCA法测定蛋白的含量。取1μL蛋白样品用0.01 mol/L的PBS稀释至20 μL，加入96孔板中，将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加至标准品孔中，用0.01 mol/L的PBS补足至20 μL。BCA试剂A和试剂B依照50∶1的比例配制BC工作液。各孔内均加入200 μL BC工作液，在烤箱中放置30 min，温度37 ℃，根据标准曲线计算出蛋白浓度。蛋白样品中加入上样缓冲液(2×Loading buffer)后充分混匀，100 ℃条件下煮10 min。以SDS-PAGE凝胶电泳分离目的蛋白，蛋白上样(上样量为每孔20 μg)后，恒压80 V条件下电泳，待样品进入分离胶后将恒压调整为120 V，时间约60 min。将分离好的蛋白质从凝胶转移至PVDF膜上，后恒电流300 mA转膜90 min。以体积分数0.05脱脂牛奶室温封膜2 h，分别添加一抗孵育(anti-P2X4，1∶200；anti-TH，1∶4 000；anti-caspase-1，1∶2 000；anti-GAPDH，1∶10 000)，4 ℃摇床过夜。第2天用PBST洗涤3次，加入二抗(HRP标记的山羊抗兔IgG，1∶10 000)后室温下摇床孵育1 h，PBST洗涤3次进行显影，用ImageJ软件分析各条带灰度值。实验结果以目的蛋白与GAPDH条带灰度的比值表示目的蛋白的表达水平，所得结果进行统计学分析。

1.6 免疫荧光染色

参照相关文献报道的方法[10]。各组剩余大鼠称体质量后以100 g/L水合氯醛麻醉，用生理盐水及40 g/L的多聚甲醛溶液经左心室灌注固定后断头，取脑组织后在40 g/L多聚甲醛溶液中4 ℃固定24 h，分别在200 g/L蔗糖溶液、300 g/L蔗糖溶液中脱水后，置于-80 ℃冰箱保存。在鼠脑冠状位连续切片时，冷冻切片机切片调整为厚度20 μm，温度为-20 ℃，采用细针将冷冻切片轻轻粘至加入0.01 mol/L的PBS的24孔板中，尽量避免损伤脑组织。冷冻切片剥离皮质部位后采用PBST冲洗，加入TH一抗(1∶2 000)、α-synuclein一抗(1∶1 000)、caspase-1一抗(1∶500)，置于4 ℃摇床孵育过夜。用PBST反复冲洗3次，每次持续5 min。加驴抗兔荧光二抗(1∶500)，室温避光摇床孵育2 h后再次用PBST冲洗3次，每次持续5 min。避光贴片，脑片周围自然干燥后用700 g/L甘油溶液封片，镜下观察。

1.7 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠黑质中P2X4、α-synuclein、caspase-1的表达情况

Western blot检测结果显示，与A组比较，B组和F组大鼠黑质内P2X4表达明显增加，差异有统计学意义(F=111.9，P<0.01)；C组、D组大鼠黑质内P2X4表达较F组明显减少，差异有统计学意义(P<0.01)。与A组比较，B组大鼠黑质内α-synuclein的表达明显增加，差异具有统计学意义(F=152.9，P<0.01)；D组大鼠黑质内α-synuclein表达较F组减少，差异有统计学意义(P<0.01)。与A组比较，B组大鼠黑质内caspase-1表达明显增加，差异具有统计学意义(F=141.3，P<0.01)；D组大鼠黑质内caspase-1蛋白表达较F组明显减少，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1，图1。

2.2 各组大鼠黑质中TH阳性的多巴胺能神经元数量比较

免疫荧光染色结果显示，干扰慢病毒在黑质TH阳性的多巴胺能神经元中稳定表达(图2)。与A组比较，B组和F组黑质TH阳性多巴胺能神经元数量明显减少，差异具有统计学意义(F=27.16，P<0.01)；与F组比较，C组和D组大鼠黑质内TH阳性多巴胺能神经元数量明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)。与A比较，C组和E组大鼠黑质内TH阳性多巴胺能神经元数量差异无显著意义(P>0.05)。见表1，图3。

组别P2X4α⁃synucleincaspase⁃1TH阳性多巴胺神经元数量A组0．596±0．0150．652±0．0330．562±0．0167363．0±171．7B组1．129±0．0371．254±0．0341．064±0．0215320．0±269．0C组0．678±0．0350．536±0．0170．666±0．0186940．0±141．5D组0．841±0．0381．071±0．0400．784±0．0256132．0±165．7E组0．458±0．0170．594±0．0190．734±0．0117250．0±246．0F组1．232±0．0231．337±0．0231．204±0．0304799．0±203．7

图1 各组大鼠中α-synuclein、P2X4、caspase-1蛋白的表达

A为TH在大鼠黑质中表达情况；B为重组慢病毒在大鼠黑质中表达情况；C为重组慢病毒在TH阳性的多巴胺能神经元中表达情况。TH染色，400倍。

图2TH阳性的多巴胺能神经元慢病毒的转染情况

①、②、③、④、⑤、⑥分别为A、B、C、E、D、F组。TH染色，100倍。

3 讨 论

PD的典型病理特征为中脑黑质致密部多巴胺能神经元丢失、以α-synuclein为主要成分的路易小体形成以及纹状体多巴胺水平降低[11]。尸检发现，PD病人的黑质中有大量活化状态的小胶质细胞，而且活化的小胶质细胞数量与神经变性程度呈正比[12-13]。小胶质细胞对α-synuclein有很强的内吞、降解作用，当小胶质细胞被激活后，对α-synuclein的降解作用降低，未被降解的α-synuclein可发生错误的折叠而异常沉积在胞质内，造成小胶质细胞进一步激活[14]。这种正向的反馈使α-synuclein持续沉积，造成细胞内线粒体功能障碍、内质网-高尔基体囊泡运输障碍，增加多巴胺神经元的氧化应激，加快多巴胺能神经元的死亡进程[15]。

P2X4受体作为一种分布广泛的嘌呤能受体，在大脑、脊髓、自主和感觉神经节和垂体前叶均有分布[16]。P2X4异常的上调及活化引起的免疫应答反应与多种疾病的发生发展有关，与神经退行性疾病也有一定关系[17-19]。P2X4受体激活后可诱导下游的信号通路激活，从而调控前列腺素、IL-1、TNF-α、IL-6、caspase-1等炎性因子活化，参与包括周围炎症性疼痛、糖尿病肾间质性炎症、癫痫等疾病的病理过程[20]。最新研究表明，P2X4受体通过激活小胶质细胞参与了慢性乙醇中毒引起的神经退行性损伤的炎性发病机制[21]，我们推测P2X4表达上调可能也参与了PD的发生过程。

本实验结果显示，在6-OHDA诱导的PD大鼠模型中，大鼠黑质中P2X4、α-synuclein的蛋白表达水平较正常对照组有所升高，PD模型中黑质内TH阳性多巴胺能神经元细胞数量明显下降，这些结果表明P2X4可能参与了PD的发病过程。使用抑制P2X4表达的慢病毒预处理后，大鼠黑质中P2X4蛋白表达较PD组有所下降，TH阳性多巴胺神经元细胞数量上升，说明干扰P2X4表达可抑制TH阳性多巴胺能神经元的死亡，大鼠黑质中α-synuclein的蛋白水平较PD组下降，TH阳性细胞数升高，进一步验证P2X4表达下调可起到神经保护作用。为了明确P2X4表达下调在PD的炎症机制中的具体作用机制，本研究还对caspase-1蛋白进行了检测。caspase家族是一类半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶，不仅在炎症反应中起重要作用，而且介导了某些特定类型细胞的凋亡。caspase-1可被炎症小体激活，通过切割IL-1β、IL-18前体，促进多种炎症因子释放参与炎症反应[22]。已有研究表明，caspase-1与α-synuclein的聚集与神经细胞毒性作用有直接关系[23]。从本实验结果可以看出，各组大鼠之间黑质中P2X4、α-synuclein与caspase-1蛋白结果的变化是基本同步的，P2X4表达下调可直接或间接下调caspase-1的表达，由此推断P2X4表达下调可通过抑制caspase-1的表达来减少α-synuclein的表达。

综上所述，本实验通过检测大鼠黑质内TH阳性多巴胺神经元细胞数量以及P2X4、α-synuclein、caspase-1蛋白表达量的变化，证实P2X4在PD模型发病机制中具有一定作用，P2X4表达下调能够影响α-synuclein的表达，对大鼠黑质内的多巴胺能神经元起保护作用，这为PD的病因治疗提供了新的思路。

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