我国传统干酪中生物胺含量检测分析

刘 蕾，牛天娇，陈历水*，夏 晗，常圆圆，王 冶

（1.中粮营养健康研究院有限公司 品牌食品研发中心 老年营养食品研究北京市工程实验室 营养健康与食品安全北京市重点实验室，北京 102209；2.蒙牛高科乳制品（北京）有限责任公司，北京 101107）

生物胺是氨分子中1～3个氢原子被烷基或芳基取代后而生成的物质[1]。生物体自身合成的适量生物胺具有促进生长、增强代谢活力等生理功能。同时，生物胺也是一类对多种行为有潜在效应的神经递质，是多数有精神作用功能的分子和精神类药物的作用靶点[2]。人体除了自身合成生物胺之外，主要通过食用微生物参与/混入加工的食品或饮品摄入。发酵型干酪、发酵肉制品、发酵酒等产品中生物胺含量较高，其含量与原料、加工或发酵工艺及贮存条件等均直接相关[3-6]。

消费者在食用含过量酪胺的干酪后出现严重的高血压症状[7]，造成血管膨胀，导致血压波动和头痛、肠部痉挛、腹泻和呕吐等[8-9]。尤其是腐胺、尸胺、精胺和亚精胺可以与食物中的亚硝酸盐反应产生致癌物质亚硝胺，增加了其毒性[10]。有学者调查了韩国市场上发酵乳制品中生物胺含量，发现在搅拌型和饮用型酸奶中生物胺分别为2.50～26.66 mg/kg和0.14～17.25 mg/kg，其中搅拌型酸奶中组胺含量相对较高，但在饮用型酸奶中尸胺含量相对较高[5]。目前，发酵乳制品已成为中国乳制品行业新的增长点[11]，但是对我国市售发酵乳制品中生物胺含量方面研究较少，尤其对我国边疆地区传统干酪中生物胺含量的调查鲜有报道。欧美国家的干酪种类多样，以酶凝干酪为主，多种干酪有较长的后熟过程。目前，学者研究了多种不同干酪中生物胺的含量，其中组胺和酪胺是干酪中含量较高的生物胺。IBRAHIM E M等[12]利用高效液相色谱法测定了埃及市场上切达干酪、Ras干酪和高德干酪中酪胺、组胺和尸胺的含量，结果表明切达干酪中含有最高的酪胺和尸胺含量，分别为221.2 mg/kg和103.6 mg/kg；Ras干酪中组胺含量最高，为174.3 mg/kg。BONETTA S等[13]报道了意大利羊乳干酪（Robiola di Roccaverano）中的生物胺含量，结果表明，酪胺是含量最高的生物胺，在样品中均含有组胺，在后熟的干酪样品中，酪胺和组胺最高量分别可达2 067 mg/kg和1786mg/kg。本研究利用反相高效液相色谱（reversed-phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC）法对我国市售传统干酪产品中8种主要生物胺的含量进行测定，以期为我国传统发酵乳制品的安全生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺的标准品（纯度＞99%）、丹磺酰氯（纯度＞99%）：美国Sigma公司；甲醇（色谱纯）：美国Merck公司；超纯水由Millipore超纯水系统制备。其他试剂均为国产分析纯。

17种干酪样品：购于内蒙古、新疆、西藏、云南、北京等地市场。

1.2 仪器与设备

LC-20AT高效液相色谱仪、SPD-M20A双波长紫外检测器：日本岛津公司；Biofuge Primo离心机、19.5L（2842）水浴锅：美国Thermal Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 干酪中生物胺含量的测定

实验方法参照国标GB/T 5009.208—2016《食品安全国家标准食品中生物胺的测定》中的反相高效液相色谱法，具体方法如下：

（1）标准溶液的配制

制备色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺质量浓度为100.0 μg/mL的混合标准品工作液，并稀释成0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.5 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、15.0 μg/mL、20.0 μg/mL的生物胺标准混合系列溶液。用丙酮配制10.0 mg/mL的丹磺酰氯储备液。所有溶液均避光保存于4℃冰箱中。

（2）样品前处理

样品前处理方法参照GB/T 5009.208—2016《食品安全国家标准食品中生物胺的测定》，并稍作修改。称取搅碎后的干酪样品10.00 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入20 mL 0.1 mol/L盐酸溶液，混合均匀，匀浆提取30 min，3 600r/min离心10min，收集上清液于50mL容量瓶中；残渣重新提取。上清液合并，用0.1 mol/L盐酸溶液稀释至刻度，过滤至烧杯中。

取15 mL样品提取液加入50 mL离心管中，加入10 mL正己烷，在漩涡混合器上混匀2min后静置分层（或3600r/min离心5 min），弃去正己烷层，再加入10 mL正己烷重复操作1次，分层后取出正己烷层，保留提取液。

向上述提取液中加入适量NaCl至饱和，移取上述饱和后的提取液置于50 mL离心管中。取10 mL的溶液于50 mL的离心管中，加入1.3 mL 2.0 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH=12。加入5 mL的正丁醇-三氯甲烷（1∶1，V/V），漩涡混合振荡5 min，3 600 r/min离心10 min，吸取有机相，重复萃取2次，合并萃取液于25 mL具塞试管中。加入0.2 mL的1.0mol/L盐酸，混合后在40℃条件下氮气吹干。加入0.5mL的0.1 mol/L盐酸溶液溶解残留物，待衍生。

（3）样品衍生

取0.5mL混合标准品工作液或样品，置于具塞试管中，加入200 μL 2.0 mol/L氢氧化钠溶液，300 μL饱和碳酸氢钠溶液、10 mg/mL丹磺酰氯溶液1.0 mL，在旋涡振荡仪上混合振荡，置于60℃恒温水浴锅中反应30 min，期间取出振荡两次。加入50 mg/mL谷氨酸钠（用饱和碳酸氢钠配制）100 μL，振荡后60 ℃保温15 min，取出，加入1.0 mL超纯水，40℃水浴条件下用氮气除去丙酮。之后加入3.0 mL乙醚，旋涡振荡仪上混合2 min，静置，待分层后取出上层有机相，加入3.0 mL乙醚重复萃取2次，合并乙醚萃取液，40℃条件下氮气吹干。加入1.0 mL甲醇溶解残留物，振荡混合。用0.22 μm有机膜过滤，滤液待测。

（4）反相高效液相色谱法色谱条件

色谱条件：欧姆尼C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：30℃；流动相A：超纯水；流动相B：甲醇；流速：1.0 mL/min；流动相梯度洗脱程序见表1；进样量20 μL；紫外检测波长254 nm。色谱工作站为日本岛津公司的LC Solution系统。

表1 利用反相高效液相色谱测定8种主要生物胺的梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program of 8 main biogenic amines analysis by RP-HPLC

1.3.2 数据处理

所有的干酪样品均制备3个平行样品，重复测定3次。根据试验结果采用SPSS（16.0版）计算平均值和标准偏差，并进行方差分析与相关性分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线回归方程、检出限和定量限

将0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL标准溶液依次进样，按照各标准品峰面积（Y）对相应的标准溶液质量浓度（X）作标准曲线，计算标准曲线的回归方程及相关系数。以信噪比（S/N）＞3作为检出限的判断标准，以信噪比＞10作为定量限的判断标准，结果见表2。

表2 生物胺衍生物标准曲线的回归方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限Table 2 Regression equations of the standard curve,correlation coefficients,linearity range,limits of detection and limit of quantitation of biogenic amines derivatives

由表2可知，各生物胺衍生物线性回归方程在0.50～20 μg/mL范围内，线性相关系数R2均≥0.990，符合测定的要求。各生物胺（除了组胺）的检出限在0.172～0.443μg/mL，定量限在0.520～1.341μg/mL，组胺的检出限为3.325μg/mL，定量限为10.075 μg/mL。结果表明该方法对生物胺（除组胺）灵敏度高，可以满足样品测定的要求。

2.2 精密度试验

在对10 μg/mL混合标准衍生样品连续进样5次的试验中，色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺测定，计算结果的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）结果见表3。由表3可知，保留时间RSD值均＜2%，生物胺质量浓度的RSD值均＜5%（尸胺、组胺除外），精密度符合检测要求。

表3 精密度试验结果Table 3 Results of precision tests

2.3 加标回收率试验

在样品中加入质量浓度为10 μg/mL的混合标准品工作液，平行测定6次，8种生物胺的加标回收率见表4。由表4可知，各生物胺的加标回收率在94.9%～114.4%，经计算其回收率的RSD值均＜10%，因此该方法准确可靠，可用于检测干酪中生物胺的含量。

表4 干酪样品中生物胺的加标回收率试验结果Table 4 Results of recovery rate tests of biogenic amines in cheese samples

2.4 中国传统干酪样品中生物胺含量

本研究对17种中国传统干酪样品中8种主要生物胺含量进行测定，结果如表5所示。在17种干酪样品中，均可检测到不同含量的8种生物胺，不同干酪样品间生物胺含量在1.296～41.268 mg/kg，原因可能是由于样品均为自然发酵而成，原料和环境因素的不同，直接导致不同干酪样品中微生物组成不同，进而使得不同干酪样品之间生物胺含量差别较大[14]。王晓雯[14]利用高通量测序技术分析了14种新疆哈萨克族传统奶酪的菌群组成，结果表明不同样品中微生物群落表现出一定的种类差异和地区差异，乳杆菌（Lactobacillus）、肠球菌（Enterococci）、明串珠球菌（Leuconostoc）及微球菌（Micrococci）在样品中的相对丰度不高，但在各样品中均有分布，各样品间的菌群多样性表现出差异；蒋利亚等[15]报道了内蒙古海拉尔地区的传统发酵乳制品中乳酸菌和酵母菌的种类，其中分离得到乳酸菌16株，酵母菌11株。因此，不同地区干酪样品中微生物组成存在较大差异。目前，在乳品工业中作为发酵剂使用的一些微生物（如瑞士乳杆菌等），已被确认具有产组胺的能力。肠球菌是多种手工干酪中天然菌群的重要组成部分，GALGANO F等[16]认为在Semicotto Caprino干酪中肠球菌具有较强的脱羧酶活性，可以酪氨酸和苯丙氨酸为底物分别产生酪胺和2-苯乙胺，但不能产生组胺和腐胺。

在17种干酪样品中，有14种样品的生物胺含量低于10 mg/kg，只有3种样品中生物胺含量超过10 mg/kg，其中干酪样品10中生物胺含量为41.268mg/kg，为所有样品中生物胺含量最高的样品，这是由样品中腐胺含量较高导致的（21.850 mg/kg）。干酪样品1中生物胺含量为18.457 mg/kg，主要是由较高的组胺含量引起的（11.360 mg/kg）。目前，在乳制品中生物胺含量还没有官方限量规定，根据在鱼及鱼类制品中规定组胺含量≤100 mg/kg，总生物胺含量≤1 000 mg/kg。但据文献报道，组胺是8种主要生物胺中毒性最强的生物胺，干酪样品1中高含量的组胺可能存在安全隐患[17]。通过以上样品中生物胺含量比较可以得出，不同样品中含量较高的生物胺种类不同。原因可能是不同样品间原料、加工工艺不同，导致微生物菌群差异，直接造成各样品中含量较高的生物胺种类不同[18]。

表5 中国传统干酪样品中生物胺含量检测结果Table 5 Detection results of biogenic amines contents in Chinese traditional cheese samples

有文献报道[19]，干酪中检测出的生物胺主要有酪胺、组胺、尸胺、腐胺、色胺和β-苯乙胺等，其中酸凝干酪的生物胺含量最高，平均含量为1 460 mg/kg，其次是水洗干酪（220～388 mg/kg），蓝纹干酪（188～351 mg/kg）和硬质干酪（167～318 mg/kg），新鲜干酪（32.1～172 mg/kg）中生物胺含量最低。干酪中生物胺的产生主要在后熟过程中，是微生物在干酪后熟过程中使蛋白质水解及氨基酸脱羧而产生的。有研究发现意大利Semicotto Caprino干酪中所有生物胺在后熟过程中均呈增加的趋势，其中腐胺、色胺和酪胺的增加比较多。在后熟的前15 d之内没有检测到组胺，但在后熟结束（60 d）时能检测到104 mg/kg的组胺。在后熟过程中，生物胺含量的增加与游离氨基酸含量的增加呈现相关性，其中产生物胺的菌株都具有较好的水解蛋白质的活性[16]。在本研究中，由于采用的我国传统干酪样品均采用自然发酵，没有长的后熟过程，以新鲜干酪为主，因此，其中生物胺的含量远远低于国外经过后熟的干酪中生物胺的含量[16]。

2.5 干酪样品中生物胺含量的相关性分析

为探索生物胺相互之间的关系，本研究对干酪中不同种类生物胺含量之间的相关性进行分析，结果如表6所示。由表6可知，色胺除了与苯乙胺显著相关外（P＜0.01），与其他6种生物胺均没有显著相关性；腐胺与尸胺、酪胺、亚精胺之间均具有显著相关性（P＜0.01）；尸胺与腐胺、酪胺、亚精胺和精胺之间均具有显著相关性（P＜0.01）；组胺与精胺（P＜0.01），酪胺和亚精胺之间具有显著相关性（P＜0.01）。原因可能是游离氨基酸含量不同，也就是生物胺产生的底物浓度之间没有相关性、还有产脱羧酶活性的细菌、非发酵剂等不一致[20-21]，比如一些乳酸菌（Lactobacilli）的混合菌可生成组胺、酪胺和尸胺，而一些耐盐的Lactobacilli可以生成大量的尸胺，一定程度上也形成酪胺；肠杆菌（Enterobacteriaceae）则可能有生成腐胺和尸胺的能力等[22]。

表6 生物胺含量之间的相关性Table 6 Correlation of the biogenic amines contents

3 结论

本研究利用反相高效色谱法对中国市场上传统干酪中生物胺的含量进行了研究。结果表明，反相高效液相色谱法检测结果准确可靠，可用于测定干酪中生物胺含量。在所采集的17个样品中8种生物胺含量多少不一，生物胺总量在1.296～41.268 mg/kg范围内，均符合国家相关标准规定要求，仅有3个样品生物胺含量较高，其中有14个样品的生物胺总量低于10 mg/kg。第10号干酪生物胺含量为41.268 mg/kg，为所有样品中含量最高，其次为第1号样品和第9号样品，分别为18.457 mg/kg和10.353 mg/kg。但与国外干酪相比，中国干酪中生物胺含量均远远低于危害含量。相关性分析显示，色胺与苯乙胺，腐胺与尸胺、酪胺、亚精胺之间，组胺与精胺之间，酪胺与精胺之间在0.01水平上具有显著相关性，具体产生机理需进一步研究。

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