不同干酵母发酵豆粕的挥发性成分分析

李 开，宋 昊，王 冬，郑玉芝*

（1.北京一轻研究院，北京 101111；2.北京市食品工业研究所，北京 100075）

豆粕含有40%～60%的蛋白质，除此之外，还含有硫胺素、核黄素、烟酸等维生素以及大豆低聚糖、大豆异黄酮等活性成分[1]；大豆蛋白是公认的一种全价蛋白，含有人体所需的9种必需氨基酸[2-3]。

不良风味一直以来都是大豆类产品在食品工业中深度开发利用的主要障碍，目前已有许多关于大豆类产品风味物质的研究。BOUÉ S M等[4]跟踪研究了大豆在不同发育时期的挥发性化合物，总共鉴定出49种化合物，主要包含酯、酮、醇。LV Y等[5]在豆浆中鉴定出8种豆腥味化合物和4种非豆腥味化合物。研究表明，含有大豆蛋白产品的不良风味（如豆腥味）主要是由不饱和脂肪酸的氧化所引起的[6]。黄友如等[7]研究表明，乙醇处理能有效改善大豆分离蛋白的风味，主要是由于乙醇处理去除了1-辛烯-3-醇和降低了己醛、乙酸乙酯等的含量。施小迪等[8]利用β-环糊精包埋技术显著降低了豆乳中的豆腥味。SURATMAN L L I等[9]发现，α-环糊精降低豆奶中豆腥味的效果更好。另外，也有将微生物发酵技术应用于大豆类产品风味的改善，LEEJEERAJUMNEAN A等[10]用芽孢杆菌发酵大豆后，发现风味化合物的含量增加了100倍。BLAGDEN T D等[11]发现，乳酸杆菌和链球菌能降低豆奶气味物质中甲醇和乙醇的含量。目前，还鲜见关于豆粕及豆粕发酵后的挥发性成分的研究。

本研究采用4种不同品牌的干酵母发酵豆粕，利用顶空固相微萃取（headspacesolid-phasemicroextraction，HS-SPME）和气相色谱-质谱联用（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS），采用主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA）对豆粕发酵前后的挥发性物质进行分析研究，以期为更好地开发利用豆粕有价值的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆粕（食品级）：山东禹王实业有限公司；安琪酵母：安琪酵母股份有限公司；马利酵母：新疆马利食品有限公司；舒可曼酵母：广西湘桂酵母科技有限公司；超凡酵母：山东圣琪生物有限公司。

1.2 仪器与设备

7890A-5975C气相色谱质谱联用仪：美国安捷伦科技有限公司；SPME手动进样器、HS-SPME萃取头（50/30 μm二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷）：美国Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 豆粕发酵

称取干酵母0.5 g置于三角瓶中，加入50 g去离子水，在37℃条件下振荡培养箱中振荡培养1h，备用；称取豆粕50g置于培养盒中，倒入准备好的酵母培养液，混匀，在37℃恒温培养箱中发酵2 h（发酵时间来自酵母粉说明书）。

1.3.2 顶空-固相微萃取

[12]的方法，取适量的样品，置于15 mL顶空样品瓶中，密封，60℃平衡30 min。将预先进行高温老化后的SPME针头插进顶空样品瓶中，推出萃取纤维头，在60℃进行顶空固相微萃取30 min，最后将萃取头插进气相色谱仪进样口，240℃解吸5 min，进行GC-MS分析。

1.3.3 GC-MS检测条件

气相色谱条件：DB-WAX石英毛细柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）色谱柱；进样口温度：240℃；升温程序：40℃保持3 min，以5℃/min升至120℃，保持4min，8℃/min升温至200℃，保持8 min，10℃/min升至240℃，保持10 min；载气氦气（He）流速1.5 mL/min，不分流。

质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源；电子能量70 eV；传输线温度240℃；离子源温度230℃；母离子285 m/z；激活电压1.5 V；质量扫描范围35.00～500.00 m/z。

1.3.4 数据处理

利用安捷伦质谱数据处理系统结合NIST 11标准质谱库对总离子流色谱图中的各峰进行检索，确定每个峰对应的化学成分，并用峰面积归一化法计算各化学成分的相对含量。利用Matlab 2016b对4种不同酵母发酵豆粕中的挥发性成分进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 豆粕的挥发性化学成分

发酵前豆粕的挥发性成分的总离子流色谱图见图1，各组分的鉴定结果见表1。

由表1可知，发酵前，豆粕的挥发性物质包括醇、醛、酯、酸、酮和烃类。其中，醇类化合物10种，占58.13%；醛类化合物7种，占10.47%；酯类化合物6种，占16.08%；酸类化合物3种，占2.45%；酮类化合物4种，占5.11%；烃类化合物6种，占7.76%。由于烃类化合物的气味阈值较高，因此对豆粕的风味的形成贡献不大，1-辛烯-3-醇、1-己醇、酯类化合物和醛类化合物为豆粕的主要挥发性成分。1-辛烯-3-醇的相对含量为34.03%，具有不愉快的蘑菇味和油腻味，是大豆产品中的主要异味成分[13]。在豆粕的脱脂过程中，与蛋白质共价结合的脂质无法被正己烷去除，在豆粕的加工贮藏过程中这些残留脂质中的亚油酸等不饱和脂肪酸，在脂肪氧合酶的催化下，被氧化为氢过氧化物，氢过氧化物再被氢过氧化物裂解酶、氧化还原酶等催化生成1-辛烯-3-醇等醇类和羰基化合物，形成了豆粕特殊的风味[6，14-15]。

图1 发酵前豆粕的挥发性成分GC-MS分析的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components in soybean meal before fermentation analysis by GC-MS

表1 豆粕发酵前后主要挥发性成分的变化Table 1 Changes of main volatile components in soybean meal before and after fermentation

续表

续表

2.2 豆粕发酵后的挥发性成分

分别经4种干酵母发酵后的豆粕的挥发性成分的总离子流色谱图如图2所示，发酵后挥发性成分鉴定结果见表1。由表1可知，豆粕发酵后挥发性物质的类别为醇、醛、酸、萜烯、酮、杂环、酯和烃类，与发酵前相比，挥发性物质增加了十几种，萜烯、杂环是新增加的种类。

图2 不同干酵母发酵后豆粕的挥发性成分GC-MS总离子流色谱图Fig.2 Total ion chromatogram of volatile components in fermented soybean meal with different dry yeasts analysis by GC-MS

发酵前后豆粕中挥发性成分按种类的数量分析结果见图3。

由图3可知，在安琪酵母发酵后的豆粕中，共有54种挥发性成分。其中，醇类14种，占54.77%；酯类13种，占15.06%；酮类4种，占11.16%；醛类8种，占9.72%；酸类8种，占4.54%；烃类6种，占3.89%；杂环1种，占0.86%。其主要挥发性成分是1-辛烯-3-醇（14.62%）、3-甲基-1-丁醇（12.47%）、1-己醇（10.24%）、苯乙醇（9.26%）、酯类及酮类。

图3 发酵前后豆粕中挥发性成分的种类分析Fig.3 Varieties analysis of volatile compounds in soybean meal before and after fermentation

在马利酵母发酵后的豆粕中，共有51种挥发性成分。其中，醇类12种，占51.11%；酯类17种，占20.32%；酮类2种，占5.89%；醛类7种，占6.67%；酸类5种，占3.74%；烃类6种，占9.88%；杂环2种，占2.38%。其主要挥发性成分是3-甲基-1-丁醇（13.87%）、1-辛烯-3-醇（11.22%）、1-己醇（11.01%）、苯乙醇（5.44%）及酯类。

在舒可曼酵母发酵后的豆粕中，共有57种挥发性成分。其中，醇类13种，占49.57%；酯类14种，占21.83%；酮类10种，占7.96%；醛类8种，占7.94%；酸类5种，占2.83%；烃类4种，占8.34%；杂环2种，占1.39%；萜烯1种，占0.43%。其主要挥发性成分是1-辛烯-3-醇（12.02%）、1-己醇（10.96%）、3-甲基-1-丁醇（10.78%）、苯乙醇（5.18%）及酯类。

在超凡酵母发酵后的豆粕中，共有52种挥发性成分。其中，醇类12种，占49.54%；酯类13种，占20.86%；酮类7种，占8.66%；醛类7种，占9.18%；酸类6种，占3.14%；烃类4种，占6.95%；杂环2种，占1.22%；萜烯1种，占0.45%。其主要挥发性成分是1-己醇（11.24%）、1-辛烯-3-醇（10.28%）、3-甲基-1-丁醇（9.92%）、苯乙醇（4.99%）及酯类。

发酵前后豆粕中挥发性成分按种类的含量分析，结果见图4。

图4 发酵前后豆粕中挥发性成分的含量分析Fig.4 Contents analysis of volatile compounds in soybean meal before and after fermentation

由图4可知，在发酵的过程中，由于酵母经历新陈代谢，豆粕的主要风味化学成分含量在发酵前后发生了很大的变化，同时还生成了许多新的挥发性化合物，从而形成了豆粕发酵后的特殊的风味。对于醇类化合物来说，4种酵母发酵后，醇类化合物的种类有所上升，但是总体相对含量却下降。异味物质1-辛烯-3-醇发酵前的相对含量为34.03%，发酵后降幅超过50%，最低降至10.28%，这个结果可为豆类产品脱除异味提供参考依据。1-己醇具有酒香、果香，发酵后相对含量有所降低，但是变化不大。苯乙醇具有玫瑰香的风味，在未发酵的豆粕中相对含量极低，但是经过酵母发酵后，其相对含量最高升至9.26%。在酵母细胞中，苯乙醇可以经苯丙酮酸途径从头合成，也可以经过Ehrlich途径将L-苯丙氨酸转化生成[16]。另外，3-甲基-1-丁醇、1-壬醇和1-辛醇在未发酵的豆粕中未检测出，而在发酵产物中大量出现了，其中3-甲基-1-丁醇具有苹果白兰地香气，相对含量占9%以上，构成了发酵产物的主体风味物质。在酵母的发酵过程中，丙酮酸通过一系列的酶促反应合成缬氨酸，缬氨酸再经过Ehrlich途径最终生成3-甲基-1-丁醇，3-甲基-1-丁醇还可以由亮氨酸直接经过Ehrlich途径转化而成[17]。对于酯类化合物，经4种酵母分别发酵后酯的种类均增加了1倍以上，除了安琪酵母发酵后酯类的相对含量有所降低外，马利、舒可曼、超凡酵母发酵产物的酯类化合物的相对含量均升高。如具有椰子香气的γ-壬内酯的相对含量从发酵前的2.51%，最高升至4.38%；具有水果香味的乙酸己酯、甜酒香的辛酸乙酯、菠萝香的己酸乙酯、椰子香的癸酸乙酯、玫瑰花香的乙酸苯乙酯为发酵后新增加的酯。经过4种酵母的分别发酵后，豆粕中醛类化合物的相对含量由发酵前的10.47%降至10%以下，醛类化合物不构成发酵产物的主体风味化学成分，其中具有油脂气味的壬醛和具有脂肪气味的（E）-2-辛烯醛的相对含量均有明显下降。发酵后，豆粕主要异味成分的含量下降明显，说明发酵法对于豆粕的异味脱除效果显著。目前已有一些关于酵母发酵法脱除异味的应用被报道，如大豆分离蛋白的异味脱除[18]、豪猪肝的异味脱除[19]，而且包括1-辛烯-3-醇在内的异味化学成分的含量在发酵后均明显下降。酵母发酵脱除异味的机理至今还不太清楚，可能是异味成分被酵母在新陈代谢的过程中转化为其他风味良好的成分；另外，酵母含有复杂的胞内酶和胞外酶系统，一些酶可以催化异味化学成分改变其化学结构，从而去除异味。

2.3 豆粕发酵产物的挥发性成分主成分分析

主成分分析（PCA）是统计学上处理降维的一种方法，将原先的变量重新组合成一组新的互相无关的几个综合变量，并根据需求从中取出几个较少的综合变量尽可能多地反映原来变量。通过初步筛选并按照剔除原则[20]，利用Matlab 2016b对4种不同酵母发酵豆粕的挥发性化学成分进行主成分分析，结果见表2。

表2 三个主因子的特征值和方差贡献率Table 2 Eigenvalue and variance contribution rate of three principal factors

由表2可知，前2个主因子对方差的累计贡献率达到了86.13%，这说明前2个主因子能够较好地反映原始数据的基本信息。第1个主因子F1解释了总变异信息的52.04%。

酵母发酵豆粕后的挥发性成分经主成分分析后的前两个主因子的得分图见图5，豆粕经不同酵母发酵后经主成分分析后的前两个主因子得分图见图6。

图5 挥发性成分的主成分散点图Fig.5 PCA scatter diagram of volatile compounds

由图5可知，乙酸己酯、1-辛烯-3-醇乙酸酯、苯乙烯、（E）-2-辛烯醛、1-己醇和己酸乙酯在F1上载荷值接近并呈正向分布，十四酸、苯乙醇、9-十六碳烯酸乙酯、1-辛醇、乙酸苯乙酯、苯甲醛、辛酸和2-苯基巴豆醛在F1上载荷值接近并呈反向分布。1-壬醇、乙酸、γ-壬内酯和（Z）-3-壬烯-1-醇在F2上的载荷值接近并呈正向分布，正十六烷、壬酸乙酯和2,3-丁二醇在F2上的载荷值接近并呈反向分布。而按类别，酯类挥发性成分对F1的贡献率最大，醇类对F2的贡献率最大。

图6 不同酵母发酵豆粕的主成分散点图Fig.6 PCA scatter diagram of fermented soybean meal by different yeasts

由图6可知，不同酵母发酵豆粕后的挥发性成分有所差异，超凡酵母和舒可曼酵母在主成分散点图上距离较近，而与其他两种酵母的距离较远，说明三者风味可能差异较大。超凡酵母和舒可曼酵母在F1上的得分较高，酯类化合物含量相对较高；马利酵母在F2上的得分较高，醇类化合物含量相对较高，这与前面的结论基本一致。

3 结论

本研究采用HS-SPME与GC-MS结合，分析了豆粕的挥发性化学成分和4种不同品牌的干酵母发酵豆粕后的挥发性化学成分。在豆粕中共检测出了36种挥发性成分，主要成分为1-辛烯-3-醇、1-己醇、酯类化合物和醛类化合物，1-辛烯-3-醇为主要的异味成分，占34.03%。经过4种干酵母发酵豆粕后，发酵产物中检出的挥发性成分分别有54种（安琪酵母）、51种（马利酵母）、57种（舒可曼酵母）、52种（超凡酵母）。四种发酵产物的主要挥发性成分一致，为1-辛烯-3-醇、3-甲基-1-丁醇、1-己醇、苯乙醇和酯类；安琪酵母和马利酵母发酵豆粕的酮类挥发性成分种类明显少于其他两种酵母；作为主要异味成分的1-辛烯-3-醇的相对含量与发酵前相比下降明显，降幅为超过50%，其中超凡酵母发酵后含量降幅最大，降至10.28%。主成分分析法对GC-MS采集到的数据进行分析，结果表明超凡酵母和舒可曼酵母发酵豆粕的挥发性化学成分相对含量相近，特别是这两种酵母发酵豆粕的醇类和酯类挥发物成分总的相对含量相近，与其它两种酵母发酵后的豆粕差异明显。发酵菌剂的不同，发酵产物的风味成分也有一定的区别，因此研究不同酵母对豆粕发酵后产物的挥发性成分，可为改良豆粕及相关产品的风味提供理论依据。

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