1-辛烯-3-醇对HT22细胞的神经毒性

任丽圆，胡秋辉，刘建辉，谢旻皓，苏安祥，徐 辉，杨文建

（南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室，江苏 南京 210023）

天然芳香挥发性化合物扩散至空气中呈现出独特的气味，常用于防御昆虫和病原的攻击。近年来食用菌的消费量明显提升，这与其独特的风味有很大的联系。食用菌的特征风味主要由挥发性呈香物质和非挥发性呈味物质组成，八碳类化合物为最主要的挥发性化合物来源，其中1-辛烯-3-醇（又名蘑菇醇）是食用菌的典型风味物质，其含量不同时会呈现出不同的风味，包括蘑菇、泥土、湿木头的气味。1-辛烯-3-醇单独研究时多被当作蚊虫引诱剂，对于动物大脑神经系统有一定的损伤。有研究表明低剂量（体积分数0.1%）的1-辛烯-3-醇能通过降低多巴胺水平而导致黑腹果蝇的神经元变性，进一步的实验探究发现蛋白激酶B和应激活化蛋白激酶都可以防止与1-辛烯-3-醇暴露相关的多巴胺活性丧失，且与胱天蛋白酶3（caspase-3）的激活有关；另外当大鼠暴露于0.5 mg/L 1-辛烯-3-醇时，观察到一氧化氮和其他炎症标志物水平上调，表明挥发性1-辛烯-3-醇具有一定的神经毒性。急性暴露实验表明1-辛烯-3-醇能通过刺激眼部、上呼吸道并导致头痛恶心的症状。进一步的细胞实验表明1-辛烯-3-醇能引起胚胎干细胞及肺癌细胞株的活力下降。但相关神经系统疾病缺乏深入研究，具体的影响机制尚不明确。

随着生活节奏的加快，越来越多的人患有神经系统疾病，并且患病人群趋于年轻化。目前，关于神经毒性作用机制尚未明确，其可能与细胞凋亡、氧化应激、抑制神经轴生长等有关，其中氧化应激学说方面的研究占有重要地位。脑组织对氧化应激极其敏感，由于大脑代谢需要大量的氧气，这一耗氧代谢会产生更多的自由基。其中线粒体是产生氧自由基的最主要部位，参与调节细胞氧化还原电位和信号转导，调控细胞凋亡，甚至导致中枢神经系统疾病发生。另外大量研究表明，神经系统和免疫系统紧密相连，中枢神经系统中存在特有的免疫监管体系，通过炎症反应的发生来应对各种的大脑损伤。炎症发生在大脑中会促进急性或慢性大脑疾病的病程发展，且大脑中的神经元会通过调节神经营养因子、细胞因子和蛋白酶的分泌，对抗炎症的负面影响从而发挥神经保护作用。

基于此，本研究利用细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）法检测不同剂量的1-辛烯-3-醇对小鼠海马神经元细胞的活力影响，确定合适的剂量并进行后续的研究；观察细胞形态、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）基因水平的表达；测定细胞凋亡率、凋亡基因表达水平、活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的变化；测定线粒体膜电位、细胞色素c氧化酶（cytochrome c oxidase，COX）质量浓度；测定炎症因子肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α和白细胞介素（interleukin，IL）-6的mRNA相对表达水平，以探究其影响神经功能的途径，以期为1-辛烯-3-醇的神经毒性研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1-辛烯-3-醇（纯度98%） 北京索莱宝科技有限公司；小鼠海马神经元细胞系HT22细胞 湖南丰晖生物科技有限公司。

胎牛血清、Dulbecco’s改良Eagle培养基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）高糖培养基、胰蛋白酶（质量分数0.25%）、青链霉素 美国Gibco公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（1 mol/L、pH 7.2～7.4） 北京索莱宝科技有限公司；CCK-8试剂盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒（增强型）、裂解液、SOD活力测定试剂盒、MDA含量测定试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒、ROS相对含量测定试剂盒、线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）检测试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司；RNA提取试剂盒、cDNA逆转录试剂盒、荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒 南京诺唯赞生物科技有限公司；小鼠COX测定试剂盒 江苏酶免实业有限公司。

1.2 仪器与设备

HH-2恒温水浴锅 国华电器有限公司；Allegra冷冻离心机 美国Beckman Coulter有限公司；HERACell 240i二氧化碳培养箱、NanoDrop™超微量分光光度计、Tadvanced 96G梯度PCR仪、7500实时荧光定量PCR仪美国Thermo Fisher公司；ELX800多功能酶标仪 美国Molecular Devices公司；XD 30倒置式生物显微镜 北京普瑞塞斯仪器有限公司；FACSCalibur流式细胞仪美国Becton Dickinson公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞活力测定

1-辛烯-3-醇培养液的配制：先将1-辛烯-3-醇样品加入DMSO中配制为体积分数为10%的母液，之后使用含10%（体积分数，下同）DMEM的培养液进行梯度稀释。

细胞传代：将HT22细胞接种至含6 mL 10% DMEM培养液（含10%（体积分数）胎牛血清和1%（体积分数）青链霉素）的25 cm细胞培养瓶中，并置于37 ℃、5% CO细胞培养箱中培养。待细胞铺满约80%时进行细胞传代。吸弃培养液，加入2 mL PBS冲洗2～3 次，然后加入约1 mL质量分数0.25%胰蛋白酶溶液消化，待细胞脱落后加入1 mL培养液以终止消化，将培养瓶中溶液转移至离心管后以1 000 r/min离心3 min，弃去上清液。然后加入1 mL培养液将细胞重悬，转移至盛有5 mL新鲜培养液的25 cm细胞培养瓶中，8字法摇晃均匀，置于37 ℃、5% CO细胞培养箱中培养。

采用CCK-8法测定1-辛烯-3-醇对HT22细胞的活力影响。具体操作如下，用10% DMEM培养液将对数生长期的HT22细胞配制成单个细胞悬液，并调整细胞浓度为5×10个/L，按照每孔100 µL接种于96 孔板进行培养，约24 h后吸弃培养液，分别加入100 µL 0（对照，后同）、0.025%（体积分数，后同）、0.050%、0.075%、0.100%、0.125%、0.150% 1-辛烯-3-醇培养液，于37 ℃培养24 h后按照CCK-8试剂盒说明书测定细胞活力，以对照组细胞活力为100%。

1.3.2 细胞形态观察

将800 µL对数期细胞（浓度为1×10个/ mL）接种于24 孔板中，孵育24 h后弃去培养液，每孔加入800 µL 1-辛烯-3-醇培养液（作用剂量分别为0、0.025%、0.050%、0.075%、0.100%、0.125%）孵育24 h后于显微镜下观察细胞形态，放大倍数为100 倍。

1.3.3 细胞凋亡的检测

将1.5 mL浓度为2×10个/mL的HT22细胞接种于6 孔板内，37 ℃孵育24 h，之后弃去培养液，按照1.3.2节分组加入1.5 mL的1-辛烯-3-醇培养液孵育24 h。收集上层培养液至离心管中，用PBS（1 mol/L、pH 7.2～7.4）进行清洗并用500 µL质量分数0.25%胰蛋白酶溶液消化1～2 min，待细胞消化后加入离心管内的培养液以终止消化，1 000 r/min离心3 min后弃去上清液。加入195 µL Annexin V-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）试剂轻轻重悬细胞，再加入5 µL Annexin V-FITC与10 µL PI试剂混匀。参考文献[18]进行室温避光孵育，采用流式细胞仪进行检测，各组每次分析1×10个细胞，使用FlowJo软件测定细胞凋亡率。

1.3.4 活性氧相对含量的测定

实验分组同1.3.2节，参考ROS相对含量测定试剂盒说明书检测细胞活性氧相对含量。

1.3.5 超氧化物歧化酶活力检测

实验分组同1.3.2节，1.5 mL浓度为2×10个/mL的细胞接种于6 孔板，经不同剂量1-辛烯-3-醇培养液孵育24 h，之后弃去培养液加入200 µL裂解液，12 000 r/min离心5 min后取上清液作为待测样品，并使用BCA法测定蛋白质量浓度，按照SOD试剂盒说明书通过黄嘌呤氧化酶偶联法测定HT22细胞内SOD活力，单位为U/mg（以蛋白质量计）。

1.3.6 丙二醛含量测定

取1.3.5节收集得到的上清液作为待测样品，通过硫代巴比妥酸法测定细胞内MDA含量，单位为μmol/mg（以蛋白质量计）。

1.3.7 线粒体膜电位的测定

实验分组同1.3.2节，参考文献[22]利用荧光探针JC-1法检测细胞线粒体膜电位。当线粒体膜电位正常时，JC-1荧光探针可进入线粒体基质中形成聚合物，产生红色荧光，即Q2区；当线粒体膜电位较低时，JC-1不能进入线粒体基质中，表现为单体形式，产生绿色荧光，即Q3区。用红、绿荧光强度的比值（Q2/Q3）表征线粒体膜电位，JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变即表明线粒体膜电位的下降。

1.3.8 细胞色素c氧化酶质量浓度的测定

取1.3.3节收集得到的上清液作为待测样品，参照试剂盒说明书测定COX质量浓度，单位为ng/L。

1.3.9 BDNF、凋亡、炎症因子相关基因的相对表达量测定

采用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，后用cDNA逆转录试剂盒将其转录为cDNA。之后采用聚合酶和SYBR荧光染料，以稀释后的cDNA为模板扩增目标基因，引物序列见表1。以为内参基因，对照组作为相对定量组，所有PCR数据均采用2相对定量法进行分析，计算BDNF、凋亡、炎症因子相关基因的相对表达水平，结果表示为相对于对照组的基因表达倍数。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences used for gene amplification

1.4 数据处理与分析

实验中各指标进行3 次重复，测定结果以平均值±标准差表示。采用Origin 2019软件作图，采用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析，采用Duncan检验进行显著性分析，＜0.05表示有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 不同剂量1-辛烯-3-醇对HT22细胞活力的影响

用0、0.025%、0.050%、0.075%、0.100%、0.125%、0.150% 1-辛烯-3-醇培养液处理HT22细胞24 h，测定细胞活力并观察细胞形态，由此来评价细胞的状态。实验结果如图1所示，与对照组相比，除0.025%剂量下细胞活力无明显变化，随着1-辛烯-3-醇剂量的增大，各组细胞活力显著下降（＜0.05），且呈现明显的剂量依赖性。1-辛烯-3-醇体积分数为0.050%时，细胞活力为（86.68±19.40）%；当样品体积分数增至0.075%时，细胞活力急剧降至（30.05±9.08）%。由此可见，0.050% 1-辛烯-3-醇处理对神经细胞有明显的损伤作用。

图1 不同剂量1-辛烯-3-醇处理24 h条件下 HT22细胞的活力Fig. 1 Effect of different concentrations of 1-octen-3-ol for 24 h on viability of HT22 cells

进一步在显微镜下观察HT22细胞在不同剂量1-辛烯-3-醇作用24 h后的形态及数量变化，结果如图2所示。对照组细胞形态为星状形，细胞密度大，有明显的细胞团簇在一起，表现出明显的活力状态。经过1-辛烯-3-醇处理的细胞数量明显减少，形态偏向于圆形，箭头指示的细胞表现出明显的形态变化，典型的星状形变成圆形，有大量漂浮状态出现，且出现大片的死细胞。其中0.100%样品处理组的细胞形态表现明显，细胞全部呈现出圆形，细胞数量明显减少，这与上述的CCK-8实验结果相互印证。

图2 不同剂量1-辛烯-3-醇处理24 h条件下HT22细胞的形态（100×）Fig. 2 Effect of different concentrations of 1-octen-3-ol for 24 h on morphology of HT22 cells (100 ×)

2.2 不同剂量1-辛烯-3-醇对HT22细胞BDNF的影响

BDNF在神经元的生存、分化、生长和维持中有重要作用，可以影响中枢神经系统的稳定性。2.1节结果表明1-辛烯-3-醇对HT22细胞活力有极大的损伤作用，因此进一步通过测定mRNA相对表达水平来研究其对神经系统的影响。结果如图3所示，当1-辛烯-3-醇处理剂量高于0.025%时，随着1-辛烯-3-醇剂量的增加，mRNA相对表达水平呈逐渐下降趋势，其中0.075%、0.100%、0.125% 1-辛烯-3-醇处理组与对照组有显著性差异（＜0.05），分别为对照组的0.65、0.31、0.08 倍。上述结果表明1-辛烯-3-醇对神经系统稳态有一定的损伤。

图3 不同剂量1-辛烯-3-醇处理HT22细胞的BDNF mRNA相对表达水平Fig. 3 Effect of different concentrations of 1-octen-3-ol on relative mRNA expression level of BDNF in HT22 cells

2.3 不同剂量1-辛烯-3-醇对HT22细胞凋亡的影响

细胞凋亡是指由基因控制的细胞为稳定内环境稳态而主动死亡的过程。如图4A、B所示，随着1-辛烯-3-醇剂量的增加，细胞凋亡率呈明显上升趋势，各剂量样品处理组与对照组均表现出显著性差异（＜0.05），其中0.075%和0.100%处理组的细胞凋亡率分别达到了（45.26±5.79）%、（64.09±8.81）%，由此可以推测，当1-辛烯-3-醇剂量在0.075%～0.100%时，便导致细胞凋亡率达到50%。这些结果表明，1-辛烯-3-醇处理可以显著诱导HT22细胞凋亡，且呈现出明显的剂量依赖性，表明1-辛烯-3-醇触发了HT22细胞凋亡从而导致细胞活力下降。

基因能够抑制细胞的凋亡，而有拮抗基因抑制细胞凋亡的作用，两者能够在细胞凋亡中起关键作用，因此进一步在mRNA水平探索1-辛烯-3-醇的抗细胞凋亡机制。如图4C所示，当1-辛烯-3-醇处理剂量高于0.025%时，/的mRNA相对表达水平呈上升趋势，其中0.100% 1-辛烯-3-醇处理组与对照组有显著性差异（＜0.05），为对照组的1.4 倍。这些结果表明，1-辛烯-3-醇的细胞凋亡作用与促进Bax/Bcl-2通路激活有关。

图4 不同剂量1-辛烯-3-醇处理HT22细胞的凋亡情况Fig. 4 Effect of different concentrations of 1-octen-3-ol on apoptosis rate of HT22 cells

2.4 不同剂量1-辛烯-3-醇对HT22细胞内ROS相对含量的影响

有研究显示ROS与细胞增殖密切相关，而且当ROS水平过高时会诱导细胞发生氧化应激反应，从而造成氧化损伤，因此检测细胞内ROS水平可以反映生物体氧化损伤的强度。结果如图5所示，剂量高于0.025%的1-辛烯-3-醇处理能够增加ROS的相对含量，且呈现剂量依赖性，其中0.100%和0.125% 1-辛烯-3-醇处理组与对照组有显著性差异（＜0.05），分别为对照组的1.9、2.5 倍。上述结果表明1-辛烯-3-醇处理能够增加ROS相对含量。

图5 不同剂量1-辛烯-3-醇处理HT22细胞的ROS相对含量Fig. 5 Effect of different concentrations of 1-octen-3-ol on ROS levels in HT22 cells

2.5 不同剂量1-辛烯-3-醇对HT22细胞内SOD活力、MDA含量的影响

作为抗氧化系统中的重要组成部分，SOD活力通常被用于评价抗氧化活性。由图6A可知，0.075%、0.100%和0.125%处理组SOD活力显著高于对照组（＜0.05），分别为对照组的1.2、1.5、1.7 倍。MDA是脂质氧化的终产物之一，其含量主要反映细胞过氧化的程度，也间接反映细胞的损伤程度。如图6B所示，0.075%、0.100%和0.125%处理组MDA的含量显著性高于对照组（＜0.05），分别为对照组的1.8、1.9、2.2 倍。上述结果表明，经过1-辛烯-3-醇处理的HT22细胞SOD活力和MDA含量均得到提高，且呈现一定的剂量依赖性。

图6 不同剂量1-辛烯-3-醇处理HT22细胞的SOD活力（A）和MDA含量（B）Fig. 6 Effect of different concentrations of 1-octen-3-ol on SOD activity (A)and MDA content (B) in HT22 cells

2.6 不同剂量1-辛烯-3-醇对HT22细胞能量代谢的影响

线粒体在细胞凋亡中发挥着中央调控的作用，线粒体膜电位是指线粒体呼吸链质子跨膜过程中内膜两侧离子浓度不同所产生的电位差，膜电位的丧失被认为是细胞凋亡的早期标志之一。本研究以JC-1染色分析1-辛烯-3-醇对HT22细胞的线粒体膜电位的影响，结果如图7A、B所示。当剂量高于0.025%时，线粒体膜电位开始逐渐下降，且呈现出一定的剂量依赖性，其中0.100%和0.125%处理组的线粒体膜电位分别为对照组的55%和49%，与对照组有显著差异（＜0.05）。这些结果表明1-辛烯-3-醇诱导的细胞凋亡可能是线粒体膜通透性增强导致的。

线粒体呼吸链是线粒体能量转化的核心与基础，由4个跨膜蛋白复合体（呼吸链膜蛋白复合体I、II、III、IV）、泛醌以及细胞色素c组成，本研究选择COX的质量浓度作为特异性指标来反映线粒体呼吸作用的变化。COX质量浓度结果如图7C所示，与对照组相比，0.050%、0.075%、0.100%和0.125%处理组COX质量浓度显著上升（＜0.05），且有一定的剂量依赖性，分别为对照组的2.0、2.2、2.8、3.0 倍。以上结果表明1-辛烯-3-醇的暴露会影响COX的分泌进而影响线粒体呼吸作用。

图7 不同剂量1-辛烯-3-醇处理对HT22细胞能量代谢的影响Fig. 7 Effect of different concentrations of 1-octen-3-ol on energy metabolism of HT22 cells

2.7 不同剂量1-辛烯-3-醇处理对炎症因子TNF-α和IL-6 mRNA相对表达水平的影响

中枢神经系统的稳态与炎症水平是紧密相连的，因此进一步通过实验探究1-辛烯-3-醇作用下HT22细胞的炎症水平变化。TNF-α和IL-6是两种促炎性细胞因子，当神经炎症发生时会导致其表达量增加。如图8所示，随1-辛烯-3-醇剂量的增加，和mRNA相对表达水平均呈增加趋势。与对照组相比，0.100%、0.125%1-辛烯-3-醇处理组mRNA相对表达水平显著增加（＜0.05），分别约为对照组的25.9、30.1 倍；与对照组相比，0.075%、0.100%和0.125% 1-辛烯-3-醇处理组mRNA相对表达水平显著上升（＜0.05），分别为对照组的9.6、10.1、14.5 倍。以上结果表明，1-辛烯-3-醇通过提高促炎因子和基因的表达对HT22细胞造成炎症损伤。

图8 不同剂量1-辛烯-3-醇处理HT22细胞的TNF-α（A）和IL-6（B）mRNA相对表达水平Fig. 8 Effect of different concentrations of 1-octen-3-ol on relative mRNA expression levels of TNF-α (A) and IL-6 (B)

3 讨 论

1-辛烯-3-醇是食用菌的特征挥发性物质，常被用作香料添加剂和蚊虫引诱剂，研究表明其能够通过作用于神经系统而对果蝇有损伤作用，而关于细胞方面的神经毒性影响缺少相关的研究，其具体的影响机制尚未明确。

中枢神经系统是神经系统的主要部分，是学习、记忆、语言和思维活动的结构基础。目前研究表明，持久的氧化应激和长期神经炎性是导致中枢神经系统损伤的主要机制。氧化应激指在机体受到不利刺激时，体内会大量产生活性氧自由基，导致氧化还原系统失衡，造成细胞及组织损伤，这会引起细胞凋亡甚至病理损伤。线粒体是与氧化代谢关系最为密切的细胞器，线粒体的氧化呼吸作用是ROS产生的主要途径，线粒体氧化呼吸链的损伤引起细胞内发生氧化应激反应，从而导致活性氧物质浓度升高，最终导致神经元的死亡，即表明氧化还原失衡时导致线粒体依赖性细胞凋亡。

本研究中高于0.025%的1-辛烯-3-醇作用导致HT22细胞活力显著降低，表明1-辛烯-3-醇在HT22细胞中具有一定的毒性。BDNF是神经营养因子家族的主要成员，其在中枢神经系统功能调节中具有重要作用，当1-辛烯-3-醇剂量高于0.025%时，HT22细胞的mRNA相对表达水平低于对照组，表明1-辛烯-3-醇的神经损伤作用可能与mRNA表达的下降有关。接下来分析了细胞凋亡情况，结果表明，1-辛烯-3-醇能引起细胞凋亡率和/基因表达升高，其中，Bax和Bcl-2是凋亡途径的典型控制蛋白，Bax水平的上升和Bcl-2水平的下降可以引起凋亡途径的激活，推测1-辛烯-3-醇能通过促进/基因表达引起HT22细胞的凋亡。进一步分析1-辛烯-3-醇处理对HT22细胞氧化应激水平的影响，结果表明氧化应激水平得到了一定程度的升高，表现为ROS相对含量、SOD活力和MDA含量增加。这是由于ROS过量产生会导致脂质过氧化产物MDA的升高，而SOD作为抗氧化系统的主要组成，在1-辛烯-3-醇的毒性作用下，HT22细胞为保护机体而刺激SOD活力增加，但细胞活力的下降导致HT22细胞的抗氧化能力难以抵抗氧化损伤，从而使得机体仍维持氧化应激的状态。本研究进一步验证了1-辛烯-3-醇通过线粒体损伤诱导HT22细胞凋亡的可能性，1-辛烯-3-醇的作用导致HT22细胞线粒体膜电位的降低以及COX分泌增加，进而诱导的上调和的下调，从而引起凋亡途径的激活。这与张亚琼的研究结果一致，其发现丙烯酰胺可能是通过增加细胞内ROS和MDA水平，产生氧化应激损伤，降低线粒体膜电位，上调Bax和下调Bcl-2蛋白的表达，进而诱发HT22细胞的凋亡，诱导HT22细胞神经元损伤。神经炎症被认为是引发多种神经系统疾病的关键，本研究中1-辛烯-3-醇的处理会导致和mRNA表达水平的增加，表明1-辛烯-3-醇介导的神经炎症与细胞凋亡是共存的。

4 结 论

本实验研究HT22细胞经过不同剂量1-辛烯-3-醇处理后活力变化及其相关的机制。结果表明，随着1-辛烯-3-醇剂量的增大，细胞活力明显降低，细胞呈现明显的分散形态且神经营养因子表达受到抑制。进一步的实验结果表明，1-辛烯-3-醇能通过增加ROS相对含量、SOD活力及MDA含量诱导细胞的氧化应激；并通过促进/的基因表达引起细胞凋亡，这可能是通过增加COX的分泌进一步降低线粒体膜电位所引起的；此外，1-辛烯-3-醇通过促进炎症因子和的分泌诱导炎症反应。综上，1-辛烯-3-醇对海马神经元细胞有明显的毒性损伤作用，细胞凋亡、氧化应激、能量代谢、炎症水平这几个方面为其主要作用途径，本实验可为研究1-辛烯-3-醇的神经毒性作用提供理论参考。