复合乳酸菌发酵怀山药工艺及其抗氧化活性

郑 苗，何 佳*，吕丹丹，宋文华，张雪雯

（河南科技大学 食品与生物工程学院 洛阳市微生物发酵工程技术研究中心 河南科技大学微生物资源开发与利用重点实验室，河南 洛阳 471023）

怀山药（Dioscorea opposita）是产自于河南焦作地区的道地的名贵中药材，药食同源[1]，口感极佳，曾于2006年获国家质检总局批准实施地理标志产品保护[2]。怀山药又被称为薯蓣、怀参、山芋等，位居“四大怀药”之首，被国外誉为“中国人参”[3]。怀山药中含有丰富的营养物质，包括淀粉、多糖、蛋白质、维生素、淀粉酶等[4]，以及胆碱、尿囊素、糖蛋白、皂苷、植酸、多巴胺、粗纤维、山药素、甘露聚糖等活性成分，具有预防心脑血管疾病[5-6]，提高机体免疫力[7-8]，调节肠道功能、助消化，健脾补肺[9]，降血糖降血脂[10]，抗衰老抗肿瘤[11-12]等功能。乳酸菌具有肠道黏附率高，定植能力强，调节肠道菌群，降低胆固醇，缓解乳糖不耐症以及分泌抗生素类物质（细菌素），提高机体免疫力和抗癌等益生作用[13-14]。

当前，乳酸菌发酵食品已成为热点[15-20]，薯类乳酸菌发酵也进入了人们的研究视野[21-25]，但以纯山药为原料，多种益生乳酸菌复合发酵尚未见报道，本试验在前期试验的基础上，以四株乳酸菌为复合乳酸菌，对纯怀山药酶解液的发酵工艺进行优化并对其产物的抗氧化活性进行了研究，以期为怀山药资源的深加工和综合利用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

怀山药：河南大张实业有限公司；高温α-淀粉酶（食品级、40 000 U/g）、果胶酶（食品级、20 000 U/g）：江苏锐阳生物科技有限公司；糖化酶（食品级、100 000 U/g）：上海蓝季生物有限公司；柠檬酸（食品级）：河南兴源化工产品有限公司；复合乳酸菌[植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）（HZLp-005）∶干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）（HZLc-017）∶鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）（HZLr-023）∶嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）（HZLa-008）=0.619%∶0.670%∶0.835%∶0.876%]：本实验室保藏；VC（分析纯）：江苏强盛功能化学股份有限公司；无水CaCl2、NaOH、FeSO4、H2O2、水杨酸、邻苯三酚、无水乙醇、Na2HPO4、NaH2PO4、K3[Fe（CN）6]、FeCl3（均为分析纯）：天津市德恩化学试剂有限公司；Tris-HCl（分析纯）：南京奥多福尼生物科技有限公司；浓盐酸（分析纯）：洛阳昊华化学试剂有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基（色谱纯）：上海蓝季生物有限公司；三氯乙酸（分析纯）：上海山浦化工有限公司；MRS培养基：广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

HH-S4型电热恒温水浴锅：北京科伟永兴仪器有限公司；SW-CJ-2D超净工作台：苏州净化设备有限公司；PHS-25 pH计：上海精密科学仪器有限公司；101-2ES电热鼓风干燥箱：北京市永光明医疗仪器公司；LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；SPX-250生化培养箱：北京市永光明医疗仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 怀山药酶解液制备

鲜怀山药→清洗→80℃漂烫10 min→去皮→切片（3～5 mm厚）→护色（0.3%抗坏血酸、0.4%柠檬酸、0.7%氯化钙）→去离子水冲洗两遍→加入5倍质量的去离子水打浆→调pH至6.5，加入占原料质量分数为0.08%的高温α-淀粉酶，85℃酶解1h→降温至55℃，加入原料质量分数0.16%的果胶酶和0.09%的糖化酶，酶解3 h（酶解液中还原糖量为5.8%）→115℃灭菌20 min。

1.3.2 菌种活化

分别从斜面上刮取2环复合乳酸菌接种于MRS液体培养基中，于37℃培养18～24 h，以一定的接种量接种到怀山药酶解液中，传代2～3次，至活菌数达到1×108以上。

1.3.3 复合乳酸菌发酵怀山药工艺条件优化

（1）单因素试验

分别考察发酵时间（8 h、16 h、24 h、32 h、40 h）、发酵温度（29℃、33℃、37℃、41℃、45℃）、复合乳酸菌接种量（1%、2%、3%、4%、5%）对乳酸产量的影响，每个处理重复3次，确定复合乳酸菌发酵怀山药的最佳条件范围。

（2）响应面试验

表1 怀山药发酵工艺条件优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optimization of Chinese yam

依据Box-Behnken设计原理，利用响应面法优化复合乳酸菌发酵怀山药的工艺条件。在单因素试验结果的基础上，以发酵时间（A）、发酵温度（B）和接种量（C）为变量，以发酵液中的乳酸含量（Y）为响应值优化复合乳酸菌发酵怀山药的工艺条件。响应面试验因素水平编码见表1。

1.3.4 抗氧化活性比较

按照参考文献[27-30]的方法，以0.05 g/L维生素C（vitamin C，VC）为对照，考察怀山药酶解液发酵前、后的抗氧化活性。

1.3.5 测定方法

乳酸含量：GB 5413.34—2010《乳和乳制品中酸度的测定》方法[26]。

羟基自由基清除率测定：水杨酸法[27]；超氧自由基清除率测定：按照参考文献[28]的方法进行；DPPH自由基清除率测定：按照参考文献[29]的方法进行；还原力测定：按照参考文献[30]的方法进行。

2 结果与分析

2.1 复合乳酸菌的单因素试验

2.1.1 发酵时间对乳酸含量的影响

图1 发酵时间对乳酸含量的影响Fig.1 Effect of fermentation time on lactic acid content

由图1可知，发酵液中的乳酸含量随时间的延长而增加，发酵32 h时乳酸含量达到最大值，为1.53%，延长发酵时间，乳酸含量趋于平稳。这是由于开始时发酵液中的营养物质丰富，乳酸菌大量繁殖，不断消耗营养物质产生大量的乳酸，产酸量达到最大值后，过酸的条件不利于益生菌的生长，产酸受到抑制，因此，32 h之后产酸量趋于平稳。因而，选取最佳的发酵时间范围为16～32 h。

2.1.2 发酵温度对乳酸含量的影响

由图2可知，发酵液中的乳酸含量随温度的升高呈现先上升后平稳的趋势，在发酵温度37℃时发酵液中的乳酸含量达到最大值，为1.26%。这是因为温度较低时，乳酸菌的酶系在温度较低时活性受到抑制，因而生长受到限制，进而导致产酸量较低，乳酸菌能够生长的温度范围为25～45℃，最适生长温度为37℃，当温度升至37℃时，乳酸菌的生长最快，因而产酸量最大。因此，选取最佳的发酵温度范围为33～41℃。

图2 发酵温度对乳酸含量的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on lactic acid content

2.1.3 接种量对乳酸含量的影响

图3 接种量对乳酸含量的影响Fig.3 Effect of inoculum on lactic acid content

由图3可知，发酵液中的乳酸含量随接种量的增加而呈现先上升后平稳的趋势。在接种量为5%时，乳酸含量达到最大值，为1.625%。在接种量为1%～3%范围内，益生乳酸菌的群体生长速度最快。这是因为刚开始发酵液中的营养物质丰富，接种量越大，乳酸菌迅速利用营养物质进行发酵。但是，接种量＞3%后，由于乳酸菌种间存在竞争营养物质用于自身繁殖的现象，一部分菌体在竞争中处于劣势而死亡，因而乳酸含量会趋于平稳。因而，选取最佳的接种量范围为2%～4%。

2.2 复合乳酸菌发酵怀山药工艺条件优化

2.2.1 Box-Behnken试验设计及结果

以发酵时间（A）、发酵温度（B）、接种量（C）为评价因素，乳酸含量（Y）为评价指标进行响应面试验，结果见表2。

用Design Expert 8.05软件对表2的试验结果进行分析，得到3个影响因素与乳酸含量之间的二次回归方程：

对该模型进行方差分析，结果如表3所示。

表2 怀山药发酵工艺条件优化响应面试验设计与结果Table 2 Design and results of response surface experiments for fermentation process optimization of Chinese yam

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，乳酸菌发酵怀山药工艺的二次模型的F值为82.43，P值＜0.000 1，说明该模型极显著，失拟项的P=0.057 1＞0.05，不显著，说明该模型的拟合度较好。同时，本研究的确定系数R2=0.9907，说明发酵液中乳酸含量结果与该模型的回归值有很好的一致性，校正系数R2Adj=0.9786＞0.9，说明试验结果中有97.86%受到所选因素的影响，只有2.14%不受影响。因此，该模型可以用来预测和分析乳酸菌发酵怀山药过程中乳酸含量。在回归方程各项方差分析结果表明，各因素对乳酸含量的影响主次为发酵时间（A）＞接种量（C）＞发酵温度（B），交互项AB对响应值影响极显著（P＜0.01），交互项BC与AC对响应值影响不显著（P＞0.05），二次项A2、B2、C2对响应值影响极显著（P＜0.01）。

2.2.2 响应曲面图分析

利用Design Expert 8.05软件对表3中的结果进行二次回归拟合得出的响应曲面和等高线如图4所示。由图4可以看出，随着发酵温度的升高，发酵液中的乳酸含量先上升后平稳，随着发酵时间的延长，乳酸产量先升高后下降，从等高线图可以清晰地看出，发酵温度所对应的等高线更陡，说明相对于发酵时间来说，发酵温度的影响更为显著；随接种量的增加，乳酸产量先上升后趋于平稳，接种量所对应的等高线更陡，说明相对于发酵时间来说，接种量的影响更为显著；随着发酵时间的延长，乳酸含量先上升后下降，随着发酵温度的升高，乳酸含量先上升后平稳，从等高线上可以看出，接种量对应的等高线更陡，说明相对于发酵温度来说，接种量的影响更为显著。

图4 发酵时间、发酵温度及接种量交互作用对乳酸含量影响的响应曲面和等高线Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation time,temperature and inoculum on lactic acid content

2.2.3 验证试验

根据Box-Behnken试验设计所得结果和二次多项式方程，利用Design-Expert8.05软件计算出最佳发酵工艺条件，乳酸菌发酵怀山药的最佳工艺条件为：发酵时间22.83 h、发酵温度37.64℃、接种量2.8%，在此条件下发酵液中的乳酸含量为1.437%。为了便于操作，将以上条件参数修正为发酵时间23 h、发酵温度38℃、接种量3%。根据修正的工艺条件，经过5次验证试验，发酵液中的乳酸含量可达到1.42%，与理论值相比，降低了0.017%，可见该模型较好的预测了试验结果。

2.3 抗氧化活性

图5 怀山药发酵前后与VC的抗氧化性比较Fig.5 Comparison of antioxidant activity of VC and Chinese yam before and after fermentation

由图5可知，怀山药发酵前后的羟基自由基清除率分别为99.55%和99.95%，而VC为54.28%，说明怀山药酶解液及酶解发酵液具有较高的清除羟基自由基的能力；怀山药在发酵前对超氧自由基的清除率较低，为15.76%，而经过乳酸菌发酵后的怀山药对超氧自由基的清除率达94.45%，为发酵前的6倍，且高于VC；怀山药发酵前后对DPPH自由基的清除率分别为73.85%和89.65%，均高于VC（51.39%）；发酵前怀山药的还原能力与0.05 g/L VC的还原能力相近，发酵后的怀山药还原能力提高了0.085，高于VC。

3结论

本试验通过单因素及响应面试验优化了复合乳酸菌发酵怀山药的工艺条件。最终确定最佳的发酵工艺条件为发酵时间23 h、发酵温度38℃、接种量为3%，在此条件下发酵液中的乳酸含量可达到1.42%。

怀山药酶解发酵液对羟基自由基、超氧自由基、DPPH自由基清除率分别为99.95%、94.45%、89.65%，较发酵前均有不同程度的提高；还原力提高了0.085。

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