蛹虫草菌静息细胞培养方法及纤溶酶的诱导研究

刘晓兰，邓永平，王汉峰，艾瑞波，王 伟，杜国军

（1.齐齐哈尔大学 食品与生物工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.黑龙江省普通高等学校农产品加工重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

血栓栓塞性疾病严重危害人类健康，纤溶酶或纤溶酶原激活剂可以直接或间接溶解血栓构成成分—血纤维蛋白[1]。纤溶酶存在于多种动物、植物和微生物中[2-4]。微生物种类多样，生长周期短，并且发酵技术相对较成熟，可在较短的时间内获得大量的目的产物[5]，因此，成为开发新型纤溶酶的主要来源。已有报道源自细菌的纳豆激酶（nattokinase，NK）[6]、枯草激酶[7]等，源自链霉菌[8]的纤溶酶，源自中华根霉[9]、镰刀霉[10]、枯青霉[11]、好食脉孢霉[1]等霉菌的纤溶酶以及源自金针菇[12]、蛹虫草[13-14]等大型真菌的纤溶酶。

静息细胞是指处于休眠状态，但能维持其生存与产物合成能力的细胞[15]。用静息细胞体系来研究酶合成的影响因子，可以排除菌体生长对酶合成的影响；而且静息细胞培养基的成分比较简单，便于对实验结果进行分析。冮洁等[16]建立了基因工程菌里氏木霉306的静息细胞培养体系，并利用该体系确定半胱氨酸、精氨酸、麦芽糖等对组织型纤溶酶原激活剂（tissue type plasminogen activator，t-PA）具有直接诱导作用。

蛹虫草（Cordyceps militaris）又称为北虫草，是药食兼用的大型真菌，含有抗癌、抗氧化等多种生理活性成分。蛹虫草菌纤溶酶的合成属于部分生长偶联型，其特征是菌体生长到达快速生长期末期，细胞仍然具有较强的纤溶酶合成能力[17]。为了排除菌体生长对酶诱导合成的影响，本实验研究了蛹虫草菌静息细胞培养方法，并利用该方法研究了酪蛋白肽对纤溶酶合成的直接诱导作用，以期为提高蛹虫草菌纤溶酶的活力提供新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验菌株

蛹虫草菌（Cordyceps militaris，保藏号：CGMCC No.2577）：分离自大兴安岭林区，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 试剂

牛血纤维蛋白原、牛凝血酶（500 U/mL）：中国医学科学院天津血研所；酪蛋白、氯化钠、尿素、葡萄糖（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 培养基

改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基：葡萄糖10 g/L、蛋白胨5 g/L、马铃薯200 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、硫酸镁0.5 g/L、琼脂20 g/L。

种子培养基：葡萄糖20g/L、蛋白胨5g/L、马铃薯200g/L、磷酸二氢钾1 g/L、硫酸镁0.5 g/L。

发酵培养基：葡萄糖20 g/L，豆饼粉50 g/L。

血纤维蛋白平板配制：称取0.125 g琼脂糖加入27 mL生理盐水中，待其溶解后，放置于45℃水浴中保温30 min，加入500 U/mL的凝血酶250 μL，混匀，制得凝血酶溶液。取1支80 mg/支血纤维蛋白原溶于27 mL HCl-巴比妥钠缓冲液（pH7.8）中，置于45℃水浴中保温5 min，制得纤维蛋白原溶液。快速取5 mL凝血酶溶液与5 mL血纤维蛋白原溶液加入直径为9 cm的平皿中，混匀，水平放置30 min后置于冰箱中备用。

1.2 仪器与设备

PYX-DHS隔水式电热恒温培养箱：上海跃进医疗器械厂；DZP-2F双层振荡培养箱：金坛市城西峥嵘仪器厂；pHS-25型酸度计：上海精密科学仪器有限公司；himac CF15RX冷冻离心机：天美科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培养方法

斜面培养：将蛹虫草菌株挑取至改良马铃薯葡萄糖琼脂斜面上，23℃培养7 d。

平板培养：挑取斜面培养物，接入改良马铃薯葡萄糖琼脂平板中，23℃培养15 d。

种子培养：用无菌打孔器在平板培养物上取出直径1.5 cm的菌块，接种到装液量为100 mL/250 mL的种子培养基，23℃、180 r/min振荡培养5 d。

液体发酵：将液体种子按10%（V/V）接种量接入液体发酵培养基中，23℃、180 r/min振荡培养5 d。

饥饿培养：将液体发酵产物在4℃、10 000 r/min条件下离心15 min，收集菌丝体，用无菌生理盐水洗涤菌丝体3次，按300 mg湿菌体/mL生理盐水配制成菌悬液，于23℃、180 r/min条件下饥饿培养5 h，即得饥饿细胞菌悬液。饥饿培养的目的是为了耗尽接入静息培养基的菌体中的纤溶酶，保证静息培养后检测到的酶活力均由静息培养所得。

1.3.2 静息培养条件的确定

将饥饿培养的菌体接入静息细胞培养基（装液量为30 mL/250 mL），通过实验确定合适的培养基组分和培养条件。

氮源的确定：以1.0g/L葡萄糖作为碳源，0.6g/LNaNO3、尿素、NH4NO3和（NH4）2SO4分别作为氮源，接种量10%，于180 r/min、23℃培养12 h后，测定生物量和纤溶酶活力。以饥饿培养后的蛹虫草生物量和纤溶酶活力作为对照1，生理盐水中培养12 h的生物量及纤溶酶活力作为对照2。确定最佳氮源后，考察最佳氮源添加量（0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L和1.0 g/L）对菌体生物量和纤溶酶活力的影响，以确定最佳碳源添加量。

葡萄糖添加量的确定：以0.6 g/L的尿素为氮源，葡萄糖添加量分别为0、0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L和1.0 g/L，接种量10%，在180 r/min、23℃培养12 h后，测定菌体生物量及纤溶酶活力。以饥饿培养后的蛹虫草生物量和纤溶酶活力作为对照1。

培养条件的确定：通过单因素试验考察接种量（8%、9%、10%、11%、12%）、培养时间（10 h、12 h、14 h、16 h、18 h）和培养基初始pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）对蛹虫草菌静息培养生物量和纤溶酶活力的影响。

1.3.3 酪蛋白肽对蛹虫草纤溶酶的诱导作用

利用蛹虫草菌发酵液中的蛋白酶（152 U/mL）水解酪蛋白（含量为2.4%，pH 7.4），水解时间5 min，水解度为1.5%。蛋白质水解度的测定采用pH-state法[18]。酪蛋白水解物中肽的分离路线见图1。

图1 酪蛋白肽的分离路线Fig.1 Separation process of the casein peptide

将实验室自制的上述5种不同的酪蛋白肽（分别为组分A、B、C1、C2、C3）加入已经优化的静息细胞培养基中，添加量为0.1 g/L，接种后于23℃、180 r/min培养12 h，测菌体生物量和纤溶酶活力，对照组不添加酪蛋白肽。

1.3.4 生物量测定

菌体生物量的测定采用称干质量法[19]。取静息细胞培养液，置于预先烘干至恒质量的滤纸上，用布氏漏斗抽干后，用蒸馏水洗涤2次，60℃烘干至质量恒定，测定菌丝体干质量，即为生物量，平行实验3次。

1.3.5 纤溶酶活力的测定方法

采用血纤维蛋白平板法测定纤溶酶活力[13]。取10 μL粗酶液点加于血纤维蛋白平板表面，37℃保温6 h后测定溶圈直径，计算溶圈面积。血纤维蛋白是构成血栓的主要成分，因此，以水解血纤维蛋白后在平板上形成的溶圈面积表示纤溶酶的活力。

1.3.6 数据统计分析

利用Excel 2003和SPSS 11.5分析软件对数据进行统计分析，并结合Duncan氏法做多重比较，实验均重复3次，结果用平均值±标准差表示（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 静息培养条件的确定

2.1.1 氮源对蛹虫草菌生物量及纤溶酶活力的影响

考察4种氮源对蛹虫草菌生物量及纤溶酶活力的影响，结果见图2。

图2 氮源对蛹虫草菌生物量和纤溶酶活力的影响Fig.2 Effect of nitrogen sources on biomass and fibrinolytic enzyme activity ofC.militaris

由图2可知，当尿素作为氮源时，生物量与对照的差异最小，纤溶酶活力最高，说明细胞处于静息状态，尿素没有影响细胞生长状态，但是对纤溶酶的合成有促进作用。其他氮源都是无机氮源，也是速效氮源，导致生物量有不同程度增加，其中硝酸钠为氮源时生物量增量最大，但是均未检测到纤溶酶活力，所以，选择尿素为静息培养基氮源。

尿素添加量对蛹虫草菌生物量及纤溶酶活力的影响见图3。

由图3可知，尿素添加量为0.2～0.6 g/L时，与对照1和对照2相比，生物量没有显著变化（P＞0.05），说明细胞仍处于静息状态；当尿素添加量为0.8 g/L时，生物量由1.07 g/L增至1.48 g/L，说明此时细胞脱离静息状态。对照1中细胞饥饿培养后测得的纤溶酶活力近似于0，对照2中细胞经生理盐水培养12 h后合成了纤溶酶，但是活力较低。随着培养基中尿素添加量的增加纤溶酶活力呈现先升高后降低的变化趋势，当尿素添加量为0.6 g/L时，纤溶酶活力最高。综上所述，确定尿素的添加量为0.6 g/L。

图3 尿素添加量对蛹虫草菌生物量和纤溶酶活力的影响Fig.3 Effect of urea addition on biomass and fibrinolytic enzyme activity ofC.militaris

2.1.2 葡萄糖添加量对蛹虫草菌生物量及纤溶酶活力的影响

葡萄糖添加量对菌体生物量及纤溶酶活力的影响见图4。

图4 葡萄糖添加量对蛹虫草菌体生物量及纤溶酶活力的影响Fig.4 Effect of glucose addition on biomass and fibrinolytic enzyme activity ofC.militaris

由图4可知，对照为蛹虫草菌细胞经过饥饿培养后测得的生物量（2.23 g/L）和纤溶酶活力（近似于0）。与对照相比，生物量随葡萄糖添加量的变化无显著变化（P＞0.05），说明在实验范围内细胞处于休眠状态。当葡萄糖添加量为0～0.8g/L时，随着葡萄糖添加量的提高纤溶酶活力呈增加趋势，当葡萄糖添加量为0.08%时，纤溶酶活力最高，继续提高葡萄糖添加量至1.0g/L时，酶活力显著降低（P＜0.05）。因此确定葡萄糖的添加量为0.8 g/L。

2.1.3 接种量对蛹虫草菌生物量及纤溶酶活力的影响

接种量对菌体生物量及纤溶酶活力的影响见图5。

由图5可知，生物量随着接种量（8%～12%）的增加呈上升趋势，但是变化幅度较小，说明细胞处于静息状态。纤溶酶活力随着接种量的增加呈现先升高后降低趋势，当接种量为10%时，纤溶酶活力最大。因此确定接种量为10%。

图5 接种量对蛹虫草菌体生物量及纤溶酶活力的影响Fig.5 Effect of inoculum on biomass and fibrinolytic enzyme activity ofC.militaris

2.1.4 静息培养时间对蛹虫草菌生物量及纤溶酶活力的影响

静息细胞培养的一个要求是在尽量短的时间内考察不同物质对微生物合成某种代谢产物的影响。如果静息培养时间过长，则会由于培养基中营养物质的耗尽，引起菌体死亡；但是如果静息细胞培养时间过短，则会由于菌体没有合成足够量的纤溶酶而使纤溶酶难以测定，增加实验的误差。因此确定合适的静息细胞培养时间对于静息细胞培养系统的建立十分重要。静息培养时间对菌体生物量及纤溶酶活力的影响结果如图6所示。

图6 培养时间对蛹虫草菌体生物量及纤溶酶活力的影响Fig.6 Effect of culture time on biomass and fibrinolytic enzyme activity ofC.militaris

由图6可知，在培养时间为10～18 h范围内，菌体生物量没有明显变化（P＞0.05），说明菌体处于休眠状态。纤溶酶的活力随培养时间的增加呈现先升高后降低趋势，当培养时间为12h时纤溶酶活力最高。因此，确定静息细胞培养时间为12 h。

2.1.5 培养基初始pH对蛹虫草菌生物量及纤溶酶活力的影响

培养基初始pH影响微生物原生质膜所带的电荷，也会影响到某些营养物质的分解和电离程度，从而影响微生物对营养物质的吸收。培养基初始pH对蛹虫草菌静息细胞生物量及纤溶酶活力的影响结果如图7所示。

图7 培养基初始pH对蛹虫草菌体生物量及纤溶酶活力的影响Fig.7 Effect of initial pH of medium on biomass and fibrinolytic enzyme activity ofC.militaris

由图7可知，培养基初始pH对菌体生物量有显著影响（P＜0.05），当培养基初始pH为6.0～7.0时，生物量较稳定；随培养基初始pH的增加，纤溶酶活力呈现先升高后降低的趋势，当培养基初始pH值为7.0时，纤溶酶活力最高，此pH值与蛹虫草纤溶酶的最适作用pH较一致[13]，因此，确定静息细胞培养基初始pH值为7.0。

优化静息细胞培养基和培养条件后得到蛹虫草菌生物量为2.38g/L、纤溶酶在血纤维蛋白平板上形成的溶圈面积为34.97 mm2。

2.2 酪蛋白肽对蛹虫草菌生物量及纤溶酶活力的影响

在微生物发酵过程中，细胞生长、代谢产物合成、营养物质的消耗、培养基组成及环境pH值的改变等因素都会直接影响到酶的合成。利用静息细胞培养系统研究酶的诱导，可以克服细胞生长等因素对酶诱导产生的影响，而且培养基组成较为简单，便于分析。

以酪蛋白肽作为纤溶酶待选诱导物，研究不同组分酪蛋白肽对蛹虫草菌生物量和纤溶酶活力的影响，结果见图8。

图8 不同组分酪蛋白肽对蛹虫草菌纤溶酶诱导作用的影响Fig.8 Effect of casein peptide with molecular mass distribution on fibrinolytic enzyme induction byC.militaris

由图8可知，和对照组相比，静息培养基中添加酪蛋白肽组分A（6 mol/L盐酸沉淀物）、C1（分子质量≤3 500 Da）可提高菌体生物量，添加组分C3（7 000 Da＜分子质量≤14 000 Da）导致菌体生物量降低，添加组分B（5%三氯乙酸沉淀物）和C2（3 500 Da＜分子质量≤7 000 Da）的酪蛋白肽对菌体生物量无显著影响（P＞0.05），表明菌体均处于休眠状态。分析酶活力可知，组分A、C1、C2和C3的酪蛋白肽均可作为蛹虫草菌纤溶酶的诱导物，而组分B的培养物中酶活力低于对照，因此不是纤溶酶诱导物。组分A、C1和C3对纤溶酶的合成与菌体生长有关，因为与对照相比，这三个组分的培养物中酶活力提高的同时生物量均有不同程度的升高或降低；培养基中添加组分C2几乎没有改变生物量，因此组分C2是直接诱导纤溶酶的合成，且诱导作用最显著（P＞0.05），高于对照264%。

酪蛋白中含有精氨酸、丝氨酸等多种氨基酸[20-21]，其中精氨酸对基因工程菌里氏木霉306表达的t-PA有直接诱导作用，使酶活力提高了39.76%[16]。蛹虫草纤溶酶是一种丝氨酸蛋白酶[13]，酪蛋白肽对其诱导作用可能与肽的氨基酸构成有关。酪蛋白肽的诱导机理将在后续工作中深入研究。

3 结论

本研究以生物量和纤溶酶活力为评价指标，对蛹虫草菌静息细胞培养基和培养条件进行了研究。确定静息细胞培养基由0.08%葡萄糖和0.06%尿素组成，培养条件为：培养基初始pH 7.0，接种量为10%，180 r/min、23℃静息培养12 h。在此条件下，蛹虫草菌生物量为2.38 g/L，纤溶酶在血纤维蛋白平板上形成的溶圈面积为34.97 mm2。通过静息细胞培养系统初步确定酪蛋白肽C2对纤溶酶有直接诱导作用，使酶活力提高了264%。本研究为蛹虫草菌纤溶酶诱导物的确定提供了研究基础，对于高产纤溶酶的发酵工艺的研究具有较重要的意义。

[1]LIU X L,KOPPARAPU N K,ZHENG H C,et al.Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme from the food-grade fungus,Neurospora sitophila[J].J Mol Catal B Enzym,2016,134:98-104.

[2]VERMA M K,PULICHERLA K K.Broad substrate affinity and catalytic diversity of fibrinolytic enzyme fromPheretima posthumous-purification and molecular characterization study[J].Int J Biological Macromol,2017,95:1011-1021.

[3]TORRES-URRUTIA C,GUZMAN L,SCHMEDAHIRSCHMANN G,et al.Antiplatelet,anticoagulant,and fibrinolytic activityin vitroof extracts from selected fruitsand vegetables[J].Blood Coagul Fibrin,2011,22(3):197-205.

[4]CHOI D B,CHA W S,PARK N,et al.Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from fruiting bodies of KoreanCordyceps militaris[J].Bioresource Technol,2011,102(3):3279-3285.

[5]艾瑞波，刘晓兰，邓永平，等.微生物发酵法生产纤溶酶的研究进展[J].食品与机械，2013，29（2）：227-230.

[6]SUMI H,HAMADA H,TSUSHIMA H,et al.A novel fibrinolytic enzyme(nattokinase)in the vegetable cheese natto,a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J].Experientia,1987,43:1110-1111.

[7]KIM W,CHOI K,KIM Y,et a1.Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced fromBacillussp.strain CK11-4 scrcened from chungkook-jang[J].Appl Environ Microbiol,1996,62(5):2482-2488.

[8]CHITTE R R,DESHMUKH S V,KANEKAR P P.Production,purification,and biochemical characterization of a fibrinolytic enzyme from thermophilicStreptomycessp.MCMB-379[J].Appl Biochem Biotechnol,2011,165(5):1406-1413.

[9]LIU X L,DU L X,LU F P,et al.Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme fromRhizopus chinensis12#[J].Appl Microbiol Biotechnol,2005,67(2):209-214.

[10]UEDA M,KUBO T,MIYTAKE K,et al.Purification and characterization of fibrinolytic alkaline protease fromFusariumsp.BLB[J].Appl Microbiol Biotechnol,2007,74(2):331-338.

[11]闵伟红，李 佳，王 影，等.高产纤溶酶霉菌固体发酵工艺条件的优化[J].食品科学，2008，29（1）：207-211.

[12]PARK S E,LI M H,KIM J S,et al.Purification and characterization of a fibrinolytic protease from a culture supernatant ofFlammulina velutipesmycelia[J].Biosci Biotechnol Biochem,2007,71(9):2214-2222.

[13]LIU X L,KOPPARAPU N K,LI Y,et al.Biochemical characterization of a novel fibrinolytic enzyme fromCordyceps militaris[J].Int J Biological Macromol,2016,94(Pt B):793.

[14]CHOI D,CHA W S,PARK N,et al.Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from fruiting bodies of KoreanCordyceps militaris[J].Bioresour Technol,2011,102(3):3279-3285.

[15]SUN W,XIAO F,WEI Z,et al.Non-sterile and buffer-free bioconversion of glucose to 2-keto-gluconic acid by usingPseudomonas fluorescens AR4 free resting cells[J].Process Biochem,2015,50(4):493-499.

[16]冮 洁，杜连祥，路福平，等.用静息细胞培养法研究影响组织型纤溶酶原激活剂生物合成的因素[J].华东理工大学学报：自然科学版，2005，31（2）：245-248.

[17]陈慧鑫，刘晓兰，李巍巍，等.蛹虫草深层培养产纤溶酶条件的优化[J].食品工业科技，2010，31（11）：216-220.

[18]NISSENJ A.Enzymic hydrolysisof food proteins[M].London and Nork:Elsevier Applied Science Publishers,1986:122-144.

[19]岑沛霖，蔡 谨.工业微生物学[M].北京：化学工业出版社，2012：139-140.

[20]胡志和，夏 磊，孙振刚，等.酪蛋白水解物中ACE抑制肽分离及氨基酸序列分析[J].食品科学，2015，36（24）：156-163.

[21]Ahmed Behdal Shazly Mohamed.水牛乳酪蛋白与牛乳酪蛋白生物活性肽的对比分析[D].无锡：江南大学，2017.