大豆疫霉细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶的生物信息分析

张 蕾， 艾 嘉， 韩毅强， 王彦杰， 晏 磊， 高亚梅， 王伟东

(黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，黑龙江大庆 163319)

卵菌是色菌界(Chromista)中一类二倍体真核微生物，包括许多重要的植物病原菌[1]。卵菌的寄主范围很广，其中包括蔬菜、果树、中药材、花卉、棉、麻、油料等重要经济作物。由卵菌引起的植物病害大多难以控制，尤其是霜霉菌(霜霉病)和疫霉菌(疫病)潜伏期短，再侵染次数多，常暴发流行而导致损失严重[2]。卵菌在进化上与真菌相差很远，进化上的差异使得疫霉菌拥有一套与其他真菌不同的致病机制，多数杀菌剂对植物疫病无效。大豆疫霉属(Phytophthorasojae)属于卵菌门的疫霉菌属，是大豆根腐病的主要病原菌之一，能在任何一个时间点使大豆染病，包括大豆的种子发育期。尽管包括大豆疫霉在内已有多个疫霉菌完成了基因组测序，但疫霉菌遗传转化困难，对疫霉菌与植物互作以及致病机理、基因功能等的研究进展缓慢[3]。

细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)，是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，其ATP 结合口袋位于较短的 N 端(β片层) 和较长的 C端(α-螺旋)之间的“叶状” 深裂，调控ATP或底物与细胞周期蛋白依赖性激酶的特异性结合[4]。细胞周期蛋白(cyclin)属于细胞周期的正调控蛋白，具有组织特异性和种属特异性[5]。CDK与细胞周期蛋白以非共价键结合形成复合物，并通过调节细胞周期蛋白的表达和降解，参与酶的调节并维持细胞周期有序进行，其中CDK为催化亚基，细胞周期蛋白为调控亚基。不同的细胞周期蛋白-CDK复合物具有不同的生物学功能，并通过CDK的底物磷酸化，实现对细胞周期不同时期的推进和转化[6-7]。完整的细胞周期过程受多种蛋白酶的调控，在动物细胞中，调控失调则会导致细胞过度增殖引发肿瘤，而通过抑制CDK的活性则可以抑制细胞的增殖[8]。目前，已经筛选到了很多CDK的抑制剂。在酵母的研究中发现，勃利霉素可以抑制Cdc28[9]。大豆疫霉同样受勃利霉素的强烈抑制，但勃利霉素是否影响其CDK蛋白还不清楚。

本研究利用生物信息学方法对大豆疫霉细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶进行分析，为大豆疫霉细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶更加深入的功能研究及其抑制剂的筛选提供基础。

1 材料与方法

1.1 大豆疫霉基因组内CDK蛋白搜索

利用CDK蛋白的保守结构域在大豆疫霉基因组数据Joint Genome InstitutePhytophthorasojaedatabase v.1.1进行序列比对分析，筛选获得大豆疫霉基因组包含的CDK蛋白，在蛋白激酶数据库kinase.com利用BLAST程序分析确定其所属类型，对其进行分类。

1.2 大豆疫霉psCdc2与酵母Cdc28同源性分析

所有预测到的细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶与酵母的细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶Cdc28蛋白质序列的氨基酸序列用MEGA[10]进行系统进化树的构建，建树方法采用邻接法(neighbor-joining method)。系统进化关系的稳健性通过 1 000 次自举法检验。将蛋白序列提交到CDD[11]进行保守区域预测，并预测其功能活性位点。将与酵母Cdc28高度同源的基因的转录序列提交到疫霉数据库的BLAST程序，数据库选择为SANGER EST，搜索EST序列。

1.3 大豆疫霉细胞周期依赖性蛋白激酶psCdc2的生物信息分析

在Expasy网站(www.expasy.org)利用ProtParam分析大豆疫霉细胞周期依赖性蛋白激酶psCdc2蛋白的基本特征，提交序列后，参数默认进行分析。利用ProtScale 程序分析蛋白质的亲疏水性，参数默认。利用Signal P程序[12]分析该蛋白是否含有信号肽，在organism group选项中选择真核生物，其他参数默认。利用TMHMM[13](http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)进行跨膜结构预测；利用ProtComp[14](http：//www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcompan & group=programs&subgroup=proloc)进行亚细胞定位预测；利用GOR4[15](https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)预测该蛋白的二级结构。利用Expasy 提供的SWISSMODEL软件对该蛋白的三维结构进行了模拟，选择自动模拟。在STRING数据库[16]利用酵母Cdc28蛋白进行搜索获得相互作用蛋白，在NCBI数据库获得其对应的核酸序列，利用NCBI的BLASTN在大豆疫霉基因组内进行相似性搜索，获得对应的同源蛋白。

2 结果与分析

2.1 大豆疫霉基因组内的细胞周期依赖性蛋白激酶

在大豆疫霉基因组共发现11个CDK家族蛋白，在蛋白激酶数据库对其进行分类，将其归为CDC2、CDC7、CDC8、CRK7等(表1)，对CDK蛋白保守序列分析表明其均为蛋白激酶超家族(PKc-like superfamily)。

表1 大豆疫霉基因组内CDK家族蛋白

2.2 大豆疫霉的细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶Cdc28/Cln2同源基因

大豆疫霉psCdc2(PHYSODRAFT_352011)与酵母Cdc28高度同源，两者蛋白质序列的一致性百分比为66%，相似性百分比为80%，在进化树的同一分支(图1)。大豆疫霉基因组数据库对其进行了初步注释，初级转录物长度1 153 bp，编码区CDS为930 bp，多肽链为309个氨基酸，基因包含1个内含子。

利用保守结构域分析大豆疫霉psCdc2(PHYSODRAFT_352011)表明其包含特异性的细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶的结构域(图2)，与酵母Cdc28蛋白的保守结构域高度相似。其主要的结构域是STKc_CDK1_like，它包括其完成功能的活性位点：ATP结合位点17个，分别为V(10)G(11)E(12)G(13)A(31)K(33)V(65)F(81)E(82)F(83)V(84)D(87)R(90)Q(131)N(132) L(134)D(145)；底物结合位点27个，分别为I(11)G(12)E(13)G(14)V(19)A(32)K(34)R(51)V(65) F(81)E(82)F(83)V(84)D(87)K(129)Q(131)N(132)L(134)D(145)L(148)T(160)E(162)V(163)T(165)W(167)G(205)D(206)。活性环(A-loop)包含24个氨基酸，位于144～167之间，氨基酸序列为GDFGLAREYGVPLRR YTHEVVTLW；CDK/cyclin相互作用界面包括12个氨基酸，分别为L(36)E(41)G(42)I(43) S(45)M(48)R(49)I(51)S(52)K(55)E(56)Y(74)。该结构域在数据库中的注释为细胞周期蛋白依赖性蛋白1-类似的丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine kinases，STKs)催化结构域。丝氨酸/苏氨酸激酶催化ATP的γ-磷酸基团转移到蛋白质的丝氨酸/苏氨酸残基。依据上述对大豆疫霉psCdc2(PHYSODRAFT_35201)序列的详细分析，认为其为酵母Cdc28的同源基因，具有相似的细胞周期调控的功能(图3)。在蛋白激酶数据库确定其为CMGC/CDK/CDC2C，与CDK2_Hsa相似性为82%，一致性百分比为66%，E值为10-114。

2.3 大豆疫霉psCdc2(PHYSODRAFT_352011)蛋白基本特征分析

对大豆疫霉细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶psCdc2蛋白的基本特征进行分析。该蛋白由20种氨基酸组成，其中亮氨酸与缬氨酸含量最高，不含有吡咯赖氨酸(Pyl)与硒半胱氨酸(Sec)。使用TMHMM工具进行跨膜结构分析，结果表明该蛋白不存在跨膜结构域。使用ProtComp分析工具进行细胞内定位分析，结果显示该蛋白都主要分布在细胞质与细胞核内。ProtParam分析结果显示，该蛋白分子量为35 478 u，等电点为8.56。该蛋白在大肠杆菌体内的半衰期大于10 h，酵母体内的半衰期大于20 h，属于稳定存在蛋白。蛋白的脂肪族系数为92.72，ProtScale程序的亲疏水性分析表明其亲水性略强(图4)。信号肽分析程序Signal P分析结果显示，该蛋白质无信号肽(图5)。

利用二级结构预测软件GOR4预测该蛋白的二级结构组成。该蛋白的二级结构组件为α螺旋占32%，β折叠占15%，无规则卷曲为53%，二级结构预测结果见图6-A。预测的三维结构见图6-B，其为单体结构，属于α/β型蛋白。

在STRING 数据库中利用酵母Cdc28基因进行分析，共发现有10个蛋白与Cdc28基因存在相互作用，形成复杂的互作网络(图7)。

利用BLAST在大豆疫霉基因组内对这些同源基因进行搜索，找到了全部的10个同源蛋白(表2)， 蛋白的一致性百分比在26%～46%，说明在大豆疫霉基因组内可能同样存在它们之间的相互作用网络，共同调节细胞周期过程。

3 结论与讨论

细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶是细胞周期顺利进行的催化剂，很多研究表明细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶家族是高度复杂的[17-19]。细胞周期的形成过程中，需要通过精密调控姐妹染色体的分离、纺锤体的形成以及细胞骨架构建，从而达到在时间和空间上高度协调一致，使得整个进程顺利进行。目前已经在致病疫霉中发现，在游动孢子囊的形成起着重要调控作用的PiCdc14基因，在菌丝生长阶段并不转录，只在游动孢子囊形成阶段特异地转录[20]。在大豆疫霉基因组中找到了它的同源基因PsCdc14基因，该基因在游动孢子囊形成的过程中发挥着同样的作用[21]。该基因与致病疫霉中的PiCdc14基因具有相似的转录模式，在游动孢子囊产生阶段、游动孢子阶段和休止孢阶段上调表达。在本研究中通过对大豆疫霉基因组进行分析，共发现了大豆疫霉中有11个CDK家族蛋白，对其中大豆疫霉psCdc2基因进行研究与功能预测，为后续研究奠定基础。

在酵母研究中发现，酵母细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶Cdc28/Cln2的有效抑制剂勃利霉素，可以抑制酵母的细胞周期，导致细胞停留在G1期，不能进行RNA和蛋白质的生物合成，不能够进入下一阶段S期[9，22]。勃利霉素在酵母中通过苏氨酰tRNA合成酶和细胞周期调节蛋白2条途径发挥作用。目前的研究发现，在大豆疫霉中勃利霉素也能通过苏氨酰tRNA合成酶途径发挥作用[22-23]，在对大豆疫霉psCdc2与酵母Cdc28进行比对时发现，两者高度同源，在进化树的同一分支，且两者蛋白的保守结构域高度相似，确定了大豆疫霉psCdc2中的细胞周期蛋白依赖性蛋白1-类似的丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine kinases，STKs)催化结构域的主要结构域STKc_CDK1_like，说明其具有与酵母相似的调控细胞周期的功能。对酵母Cdc28基因分析中，共发现有10个蛋白与Cdc28基因存在相互作用，并在大豆疫霉基因组找到其全部同源蛋白。由此推测勃利霉素对疫霉的细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶也存在抑制作用，为勃利霉素抗卵菌的多途径作用机理研究提供依据与参考。

表2 大豆疫霉基因组内与酵母Cdc28基因相互作用蛋白的同源蛋白

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