自动QuEChERS方法结合液相色谱串联质谱对玉米中133种农药的多残留分析

王济世,贺泽英,徐亚平,王 璐,彭 祎,刘潇威

（农业部农产品质量安全环境因子控制重点实验室/农业部环境保护科研监测所，天津 300191）

玉米是重要的粮食作物和重要的饲料来源。在现代农业生产中，为了减少病虫草害[1-2]，保证玉米产量，不可避免地需要使用农药[3]。然而，当食用农产品中的农药残留量超过一定水平，就可能会对人类的健康造成危害[4-5]。为了保障农产品质量安全和食用者身体健康，我国明确规定了食品中的农药最高残留限量（MRLs）。快速检测农产品中农药残留是保证食品安全的重要手段，而快速、简便、灵敏的分析方法，将成为农药残留检测的主要目标[6]。

Anastassiades等[7-8]在2003年首次提出了QuECh-ERS（快速、简单、廉价、高效、耐用、安全）方法，并对其在农药多残留检测中的简便性和广泛适用性进行了验证，现已得到广泛认可。该方法主要分为两个步骤：提取和净化。在基质前处理过程中常用乙腈作为提取溶剂，并加入专用萃取盐包去除基质中的水分等干扰物，离心后将上清液转移至净化材料中，利用分散固相萃取技术进行净化[9]。为了使QuEChERS方法适用范围更广，研究人员不断对提取溶剂，净化材料等步骤进行改进和完善[10-13]。

目前，国外也研究开发了一些自动化比较强的QuEChERS方法，但价格昂贵。而我国本立科技公司新研发的自动QuEChERS前处理设备价格低，简单快捷，具有很好的应用前景。本研究在QuEChERS方法的基础上，借助自动QuEChERS前处理设备，建立了一个更加简单、便捷的方法——高通量自动QuECh-ERS方法。为保证方法的适用性，在自动QuEChERS方法建立过程中，选择了基质较复杂的谷物——玉米进行添加回收实验，结合LC-MS/MS进行检测，并对该方法的实用性进行了验证。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

乙腈、甲醇（色谱纯，Fisher）；乙酸（优级纯，中国国药集团化学试剂有限公司）；实验用水为实验室一级水；EN法（欧盟标准）萃取盐包（美国Agilent公司）：内含4 g无水硫酸镁、1 g氯化钠、1 g柠檬酸钠、0.5 g柠檬酸氢二钠；AOAC法（美国标准）萃取盐包（美国Agilent公司）：内含6 g无水硫酸镁，1.5 g醋酸钠；陶瓷均质子（美国Agilent公司）；净化材料：无水硫酸镁、N-丙基乙二胺（PSA）及C18150 mg（美国Agilent公司）；锆珠（R101、R104）和双层提取净化管（本立科技公司）；针管式过滤膜（0.22 μm，美国 Agilent公司）。

农药标准溶液（美国Chem Service公司和德国Dr.Ehrenstorfer公司），纯度大于98%。将133种农药标准溶液用丙酮作溶剂配成5 mg·L-1混标溶液，-20℃储存备用。

玉米面粉购自天津市的超市。

1.2 仪器

涡旋振荡器（Thermo，美国）；高速冷冻离心机（Heal Force，香港）；Qtrap 4500三重四级杆质谱仪和Acquity LC100高效液相色谱仪（美国AB Sciex公司）；C18色谱柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）购于美国Waters公司。

1.3 自动前处理设备

自动QuEChERS前处理设备是一款自动程序控制分析样品制备的设备，利用强力立体“8”字振荡造成涡旋效果，实现提取效能；再与电机单向运动实现的离心功能相结合，来完成样品中待测成分的提取和净化。与配套提取管组合，开发出全新的自动QuEChERS处理方法，其流程示意图见图1。

自动QuEChERS前处理设备专用提取管由内外两层管组成，内管侧壁开若干小孔，孔上覆有只允许提取溶剂通过的半透性微孔膜。使用时，先将样品加入外管，再加入提取剂，并放入锆珠，将装有净化材料的内管插入外管内，拧紧放入提取仪中。仪器自动顺序实现两次振荡和离心。振荡时，在锆珠的帮助下，样品与提取剂充分接触混合。当振荡提取结束，开始离心时，样品受到离心力的作用，提取液与提取残渣分离，提取液透过微孔滤膜进入到内管，迅速得到洁净的上清液，再经过二次振荡与净化剂充分作用得到净化。图2为提取管的抑制渗透效果及对实际样品的处理效果。

1.4 检测条件

1.4.1 液相条件

柱温40℃，流动相A为甲醇，流动相B为0.2%醋酸铵，进样量 5 μL，流速 0.3 mL·min-1。梯度洗脱程序见表1。

上式中，和分别表示非耐用品与耐用品的价格；Ht表示消费者新购买的耐用品；Bt表示无风险债券；与分别表示非耐用品部门与耐用品部门名义工资；与表示消费者在非耐用品部门与耐用品部门的就业；Rt表示名义利率；为物质资本租金率；常量K表示物质资本，与Barsky et al. 相同，[17]我们将物质资本设定为常数，原因在于任意时期经济中可供使用的物质资本数量是一定的(取决于上一时期末物质资本存量)；Ot表示消费者获得的其他收入。定义δ为耐用品的折旧率，耐用品Dt的动态积累过程为：

1.4.2 质谱条件

气帘气（CUR）25 psi（1 psi=6.895 kPa），碰撞活化参数（CAD）中等，离子喷雾电压5.5 kV，离子源温度500℃，离子源气体1（GS1）50 psi；离子源气体2（GS2）50 psi。目标化合物的保留时间、离子对、去簇电压、碰撞能质谱条件见表2。

1.5 样品的制备

EN法：（1）称取玉米样品5 g于离心管外管中，加入混标溶液（外标法），静置30 min；（2）加入10 mL水涡旋混匀，静置 30 min；（3）加入10 mL乙腈，加入EN萃取盐包及10颗锆珠，拧紧内管（内含无水硫酸镁 450 mg，PSA 75 mg，C1875 mg）；（4）放入自动QuEChERS前处理设备开始处理。处理结束后从内管中取清液1 mL过0.22 μm微孔滤膜，待测。

图1 自动QuEChERS方法流程示意图Figure 1 Diagram of automated QuEChERS method

图2 提取管的抑制渗透效果图Figure 2 Diagram of double centrifuge tubes prevent the osmosis

表1 流动相梯度洗脱参数Table 1 The gradient elution procedure of mobile phase

AOAC法：与EN法不同的是（3）加入10 mL乙腈（含1%乙酸），加入AOAC萃取盐包及10颗锆珠，拧紧内管（内含无水硫酸镁600 mg、PSA 200 mg、C18200 mg）；其他步骤相同。

2 结果与讨论

2.1 提取时间的优化

为了探索最优的提取时间，对均质分离工作站第一阶段的振荡时间进行优化比较。本实验将第一阶段振荡时间分别设置1、2、3 min进行对比，转速1000 r·min-1，保持后面三个阶段处理时间不变：第二阶段离心 5 min，转速 4000 r·min-1；第三阶段振荡 3 min，转速1000 r·min-1；第四阶段离心3 min，转速4000 r·min-1。结果如图3所示，当第一阶段的振荡时间为2 min和3min时，回收率相近。基于效率最优化，第一阶段的振荡时间定为2 min。实验过程中，对第二至第四阶段离心振荡时间也进行了优化，但对结果影响不大。

2.2 提取方法的比较

实验对两种提取方法（EN和AOAC）进行了比较。从两种方法得到的色谱图（图4）可以发现，两种方法提取效果差异不大。但AOAC方法提取溶剂中需加入1%的乙酸，且净化材料用量较大，所以本实验采用EN提取方法。

2.3 与传统QuEChERS方法的比较

本研究将自动QuEChERS方法与传统QuECh-ERS方法进行了回收率的比较。传统方法步骤：准确称取5 g玉米于50 mL离心管中，加入混标溶液，静置30 min，加入10 mL水涡旋混匀，静置30 min，加入10 mL乙腈。加入EN萃取盐包及1颗陶瓷均质子，拧紧盖子，剧烈振荡1 min，于8000 r·min-1下离心5 min，取6 mL上清液到净化用离心管中，涡旋混匀1 min，于 8000 r·min-1下离心5 min。取上清液1 mL过0.22 μm微孔滤膜，待测。图5给出了两种方法在3个添加浓度下的回收率比较。从图中可以看出，自动QuEChERS方法与传统QuEChERS方法回收率相差不大，几乎所有受测农药回收率在70%～120%之间，通过两种方法的比较，进一步说明了自动QuEChERS方法在玉米农药多残留分析中的可行性和适用性。

表2 目标化合物的质谱参数Table 2 Optimized chromatographic parameters for the selected antibiotics

续表2目标化合物的质谱参数Continued table 2 Optimized chromatographic parameters for the selected antibiotics

续表2目标化合物的质谱参数Continued table 2 Optimized chromatographic parameters for the selected antibiotics

图3 不同振荡时间下玉米中133种农药的回收率比较Figure 3 Recoveries of 133 pesticides in corn at different oscillation time

图4 EN和AOAC提取方法得到的玉米提取化合物色谱图Figure 4 The chromatogram of corn extracts using EN and AOAC method

2.4 基质效应

图5 传统方法和自动方法在3个添加水平时的回收率箱图Figure 5 Boxplot of the recovery values obtained with the manual method and automatic method at three spiking level

式中：Sm和Ss分别表示基质标曲和溶剂标曲的斜率，当ME为-20%～20%、-50%～-20%或 20%～50%、＜-50%或＞50%时，分别表示轻微、中等、较强的基质效应。本研究基质效应（图6）的评估结果表明，69%受测农药基质效应在-20%～20%，属于弱基质效应；而溴氰菊酯、苄氯菊酯等农药表现为中等或强基质效应，所以在定量分析中使用基质标准校正曲线是必要的。

2.5 方法验证

在实验中，通过回收率、线性、定量限对自动QuEChERS方法进行了验证。

待测农药 3 个添加浓度为 20、100、500 μg·kg-1，每一浓度5个平行，得到的回收率在70%～120%，相对标准偏差低于15%。

用玉米空白基质配制 8个浓度水平（2、5、10、20、50、100、200、500 μg·kg-1），通过液相色谱-串联质谱得标准工作曲线，呈现良好的线性，相关系数在0.990～0.999。

图6 在玉米基质中受测农药的基质效应Figure 6 Matrix effects（ME）of the test pesticides in corn

本实验以目标化合物回收率在70%～120%、相对标准偏差小于20%时的最小添加浓度为定量限，在对玉米133种农药检测结果中，有119种农药的定量限为 2 μg·kg-1，相比 He 等[16]所报道的更低。

2.6 实际样品测定

对山东省10个玉米样品（S-1～S-10），采用自动QuEChERS方法进行农药残留测定。其中S-3、S-5、S-6、S-9中未检出农药残留，S-1中莠去津、乙草胺有检出，浓度分别为 20.8 μg·kg-1和 10.1 μg·kg-1；S-2中乙草胺检出浓度为6.2 μg·kg-1，毒死蜱检出浓度低于检出限；S-4 检出甲草胺 16.2 μg·kg-1，毒死蜱2.7 μg·kg-1，S-7 检出甲草胺 4.2 μg·kg-1，三唑酮 3.1 μg·kg-1，除虫脲 2.7 μg·kg-1，克百威低于检出限；S-8中检出莠去津、氯虫苯甲酰胺浓度分别为9.8、4.6 μg·kg-1；S-10 中检出 3-羟基克百威 2.9 μg·kg-1，莠去津8.3 μg·kg-1。结果表明，本方法适用于玉米中农药残留的测定。

3 结论

（1）在本研究中，通过对提取方法的比较、提取时间的优化，以及方法的验证，建立了自动QuEChERS结合液相色谱-串联质谱对玉米中133种农药的多残留分析方法。

（2）通过与传统QuEChERS方法的比较，该方法耗时短、效率高，受测农药总体回收率在70%～120%之间，相对标准偏差在15%以下，符合残留检测的要求。

（3）该方法成功应用于玉米实际样品的检测，为玉米中农药多残留检测提供方法依据。

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