布鲁氏菌病流行菌株的鉴定与分析

王会敏 ，张洪军 ，李秀慧 ，陈瑞兰 ，路广计 ，张秀丽 ，刘建民

（1.围场县动物疫病预防控制中心 068450；2.河北省动物疫病预防控制中心 050000；3.围场县农牧局 068450）

布鲁氏菌病（Brucellosis）简称布病，是由布鲁氏菌属（Brucella）的细菌（简称布鲁氏菌）引起的一种人畜共患病，为《中华人民共和国传染病防治法》规定报告的乙类传染病之一，在世界各地都有广泛流行，严重威胁人类健康，尤其在发展中国家，是受到普遍关注的世界性公共卫生问题。全世界现有布鲁氏菌病患者约500600万人，年新发病人数约有50万，全世界每年因布鲁氏菌病造成的经济损失可达30亿美元[1]。

布鲁氏菌分为6个经典的种，其中羊种、牛种、猪种、犬种4个种能够使人致病。而牛种和羊种是最为常见的人布病的病原体。据中国动物卫生与流行病学中心2013年定点监测数据统计，牛的场群阳性率34.13%、样品平均阳性率4.02%，羊的场群阳性率51.18%、样品平均阳性率4.32%。由于带菌动物是其他动物和人类布鲁氏菌病的传染源。因此从源头抑制畜间布鲁氏菌病的疫情上升趋势是控制人间布鲁氏菌病的重要前提[2]。我国人间布病的发病数呈逐年上升趋势，病原学监测研究显示在我国引起人发病的布鲁氏菌菌株主要是羊种3型[3]。

本研究从某地区分离布鲁氏菌病流行菌株，并对其进行鉴定。从而掌握此地区布鲁氏菌病的传染源和疫情流行情况，为制定切实可行的布鲁氏菌病综合性防控措施提供前期基础。

1 试验材料

采集牛的组织样品及牛奶样品，采集15头阳性牛共45份样品（牛奶及组织）。培养基、恒温CO2培养箱。其他实验耗材。

2 试验方法

将采集的脏器进行研磨后，无菌组织匀浆接种于150个选择性培养基，同时将乳汁离心沉淀上接种于50个选择性培养基中，然后将75个培养平皿放于普通培养箱37℃培养，75个培养基放于含有5%～10%的CO2培养箱中37℃培养，培养5d进行观察。

将未生长细菌的平皿，继续培养10～20d后，继续观察。

疑似阳性进行菌落观察，挑取单菌落进行单菌落划线25个平皿培养，同时进行结晶紫染色，挑取光滑型菌落接种于斜面培养基，进行CO2的需求和H2S的产生试验，用对硫堇、复红染料进行敏感性测试，用特异性抗血清进行凝集反应试验。

3 试验结果与分析

25头75份样品接种75个培养基初筛结果（见表1），分离菌株革兰氏染色检测结果（见图1），分离菌株Bruce-Ladder检测结果（见图2、图3），分离菌株生化鉴定试验（见表2）。

表1 培养基初筛结果

25份样品通过培养基进行初筛后，发现16份疑似菌落，其余未见疑似菌落，布鲁氏菌病检测为阴性。16份疑似菌落经鉴定13份牛种3型，3份羊种1型。

3.1 菌落的形态

25份匀浆在布氏琼脂培养基上培养生长5d后，16份样品的培养基上可见生长的菌落，菌落无色、圆润、表面光滑（见图1）。

3.2 布鲁氏菌株的PCR鉴定

挑取16个平板培养基上的疑似菌落进行扩大培养。以牛种A544标准株和羊种16M标准株为阳性对照。鉴定结果表明，16个疑似菌株中有13株约750bp的特异性片段，与布鲁氏菌阳性对照一致。空白对照未见特异性片段（见图2、图3）。

3.3 生化鉴定

应用常规生化试验对PCR鉴定的牛种3型与羊种1型及阴性菌进行鉴定。采用布鲁氏菌特异性血清A、M分别与待检菌株的培养物进行玻片凝集试验，同时还进行CO2需要、H2S产生、染料抑菌试验。分离的3株细菌对CO2无依赖，不产生H2S、在硫堇和碱性复红染料培养基中均能生长，9株阴性菌菌株鉴定后仍为阴性菌（表2）。

图1 分离菌株革兰氏染色检测结果

图2 分离菌株Bruce-Ladder检测结果

4 讨论

我国流行的布鲁氏菌主要有羊种、牛种、猪种，其中羊种对人的感染率最强，猪种次之，牛种较弱。此次分离到的16株地方菌株，经鉴定13株为牛种3型布鲁氏菌，3株为羊种1型布鲁氏菌。2013年钱振宇、姜霞、贾肇一等人研究，分离的8株菌株经传统分型方法鉴定均为羊种菌，羊种1型1株，羊3型6株，粗糙型羊种菌1株[4]。仅有羊种1型人畜共有，其他菌型在人间还未见报道。这也表明目前感染布鲁氏菌病的羊是主要的传染源，印证我国布鲁氏菌病流行菌株的感染强度，提醒我们对牛、羊布鲁氏菌病的监测是控制动物布鲁氏菌病的有效途径。

病原的分离是确诊布鲁氏菌的标准，分离的病原进行种型的鉴定是控制、预防和根除布鲁氏菌病的关键[5]。但现基层动物疫病预防控制机构受到人员、设备及经费的影响，主要采用血清学检测的方式进行检测，无法开展病原学监测，血清学方法存在一定的假阳性，易造成误杀，严重影响养殖者的经济收入。因此，找寻一种方法或者几种方法相结合、敏感性高的血清学检测方法，对掌握布鲁氏菌病的流行及分布情况具有重要的意义。

图3 分离菌株Bruce-Ladder检测结果

表2 分离菌株生化鉴定试验结果