西双版纳榕树-榕小蜂互惠系统中线虫多样性的初步研究

师荣荣, 苗白鸽, 彭艳琼*

(1. 中国科学院 西双版纳热带植物园, 云南 昆明 650223; 2. 中国科学院大学, 北京 100049)

榕树为桑科(Moraceae)榕属(Ficus)植物的统称,是热带地区最大的木本属之一[1].全世界已知的榕属植物800余种[2],我国已经报道的有125种,包括亚种及变种等,主要分布于我国南部和西南部地区.西双版纳地区具有极高的榕树物种多样性,已记载了74种、亚种和变种[3].此外,榕树一年四季均有挂果,为雨林中生活的各种鸟类、昆虫和微生物等提供了丰富的食物及生态位,因此被公认为是热带雨林中的关键植物类群[4-5].榕树依靠专一的传粉榕小蜂为其传粉完成有性繁殖,榕小蜂也必须依赖隐头果内的雌花子房繁衍后代;两者的互惠共生关系始于白垩纪时期,至今已协同进化了7 500万年,两者已经发展到高度专一、缺一不可的高级阶段[6-7].除传粉榕小蜂外,隐头果内还共生着一些非传粉小蜂、瘿蚊、线虫等,其中线虫伴随榕树和榕小蜂的繁殖周期有规律地生存和繁衍,这些线虫与寄主榕树及其传粉榕小蜂关系密切,并且存在明显种的专化性[8-9].因此,线虫已成为研究生物多样性及协同成种的一种非常重要的虫媒模型[8].

植食性线虫起源于寒武纪早期,与榕树及其传粉榕小蜂相关的线虫,其进化关系通过化石证据可以追溯到150万～450万年前[8],表明线虫和榕小蜂已协同进化了很长时期.Gasparrini[10]在1864年首先报道了一种裂啮滑刃线虫(Schistonchuscaprifici)与无花果(Ficuscarica)及其传粉榕小蜂(Blastophagapsenes)存在联系.20世纪80年代至今美国佛罗里达大学Giblin-Davis领导的研究小组对美国及中南美洲榕树与榕小蜂互惠共生系统中的线虫进行了系统的研究,发现与榕树及榕小蜂共生系统有关的线虫共4属:Schistonchus、Parasitodiplogaster、Tylaselvia和Teratodiplogaster,其中隶属于双胃科(Diplogasteridae)的裂啮滑刃属(Schistonchus)和寄生双胃属(Parasitodiplogaster)为寄生隐头果内的优势线虫属[8,11].这2个属的线虫都依赖传粉榕小蜂进行传播繁殖,少量线虫也发现寄生于非传粉榕小蜂体内[12].

在榕树-榕小蜂互惠共生系统中,裂啮滑刃属(Schistonchus)是植食性线虫,即线虫寄生于隐头果内的小花上,取食植物组织发育.另一类线虫是肉食性隶属于寄生双胃属(Parasitodiplogaster)的线虫,寄生于榕小蜂体内,吸取榕小蜂营养发育,直到榕小蜂死亡[8,13-14].在隐头果内无论植食性还是肉食性线虫,均借助传粉榕小蜂雌蜂进行传播繁殖.目前,国内与榕树和榕小蜂相关的线虫研究尚处于起步阶段,只有文献[15-20]对分布于广州的6种榕树线虫做了种类鉴定和描述,报道了7种寄生于隐头果内的线虫,包括寄生于高榕(F.altissima)的Schistonchusaltissimus、寄生于对叶榕(F.hispida)的S.guangzhouensis和S.centerae、寄生于小叶榕(F.microcarpa)的S.microcarpus、寄生于水同木(F.fistulosa)的S.fistulosus、寄生于笔管榕(F.superba)的S.superbus以及寄生于粗叶榕(F.hirta)的S.hirtus.与分布于我国的100多种榕树相比,已调查的6种榕树只是起点,本研究选择我国榕树分布最为富集的西双版纳热带地区,广泛开展榕树-榕小蜂互惠系统中寄生线虫的种类及多样性研究,结果不仅可以丰富该系统中的线虫种类,还对以西双版纳地区为代表的亚洲热带地区线虫多样性研究工作奠定了基础.

1 材料和方法

1.1样地介绍研究样地位于西双版纳州勐腊县勐仑镇中国科学院西双版纳热带植物园,地处21°08′N,99°56′E,海拔560m,年平均气温21.7 ℃,年平均降水1 500～1 600mm,年平均相对湿度86%.全年分为明显的干湿两季,干季从11月至翌年4月,干季又分为雾凉季和干热季.雾凉季11月至2月,干热季3月至4月.5月至10月是雨季,全年75%的降雨量集中在雨季.

1.2材料本研究选取了正处于结果期的榕树作为研究材料,其中雌雄同株14种:高榕F. altissima、小叶榕F. microcarpa、垂叶榕F. benjamina、钝叶榕F. curtipes、豆果榕F. pisocarpa、环纹榕F. annulata、劲直榕 F. stricta、菩提树F. religiosa、无柄雅榕F. concinna、曲枝榕F. geniculata、大叶水榕F. glaberrima、白肉榕F. vasculosa、硬皮榕F. callosa以及聚果榕F. racemosa;雌雄异株18种:对叶榕F. hispida、水同木F. fistulosa、木瓜榕F. auriculata、海南榕F. hainanensis、苹果榕F. oligodon、北碚榕F. beipeiensis、鸡嗉子榕F. semicordata、异形花榕F. heterostyla、斜叶榕F. tinctoria、歪叶榕F. cyrtophylla、瘦柄榕F. ischnopoda、黄毛榕F. esquiroliana、棒果榕F. subincisa、假斜叶榕F. subulata、山榕F. heterophylla、竹叶榕F. stenophylla、光叶楔叶榕F.trivia以及光叶榕F. laevis,共32种榕树,每种榕树依赖专一榕小蜂传粉获得有性繁殖.

1.3方法

1.3.1采集隐头果收集果内线虫 在32种榕树结果期,采集间花期(即种子和榕小蜂发育期)隐头果,每种榕树随机采集3～200个果,带回实验室收集果内寄生线虫.线虫的收集采用本领域运用成熟的贝曼漏斗法(baermannfunnel,图1),具体选用10cm的玻璃漏斗,下面接一段乳胶管,乳胶管上装一个止水夹,在漏斗中装入适量蒸馏水,将漏斗固定在支架上;然后把采集的隐头果,沿果内壁取下所有花组织,并切碎放置折叠好的滤纸上,再轻放入漏斗中,等待4～8h后,线虫由于其趋水性和自身的重量下沉至漏斗底部的乳胶管中,松开乳胶管上的止水夹,将管中及漏斗底部的线虫悬浮液倒入培养皿中,进行线虫的收集.

图 1 贝曼漏斗法

1.3.2线虫的收集与鉴定 采用贝曼漏斗法收集到的线虫,借助LeicaS8AP0体视镜,用昆虫针挑选处于成虫期的线虫,放入装有质量分数2%～4%甲醛的1.5mL离心管中保存线虫,最后利用LeicaDM2000 显微镜鉴定线虫种类.线虫主要通过其形态特征进行鉴定,本次对线虫的鉴定主要采用如下特征:体型大小、头部口针的有无和长短、尾部生殖器官的形状和位置、排泄孔和交合刺的形态等,并参考寄主榕树及其传粉榕小蜂种类进行综合鉴定.

2 结果

2.1隐头果内寄生线虫种类的鉴定特征在西双版纳热带植物园里对32种榕树间花期果进行抽样,采集隐头果内寄生的线虫,通过线虫的大小及头部口针的有无,可直接鉴定为2个属:裂啮滑刃属(Schistonchus)和寄生双胃属(Parasitodplogaster).裂啮滑刃属为植食性线虫,雌雄体形相似,个体小,体长为(603±10)μm(SE,n=296),头部内部有清晰的口针(图2上);相比之下,寄生双胃属的线虫也雌雄体形相似,但个体较大,体长约(800±4)μm(SE,n=106),头部无口针(图2下).再参照专一性的榕树和传粉榕小蜂寄主,结合尾部生殖器官交合刺的特征,可以鉴定到种.

2.2雌雄同株隐头果内寄生线虫的种类及多样性雌雄同株榕树及榕小蜂繁殖在同一果内完成,因此雄花期隐头果内的线虫总能找到传粉榕小蜂雌蜂,获得转移到雌花期隐头果繁殖的机会.对处于结果期的14种雌雄同株榕树的间花期果进行抽样,每种榕树分别抽样1～10株,再从5～100个隐头果内收集线虫.经普查、鉴定,7种榕树的间花期果内寄生有线虫(表1),每种隐头果内有线虫1～2种.高榕、小叶榕和垂叶榕隐头果内均发现一种已知的裂啮滑刃属线虫,分别是Schistonchus altissimus、S. microcarpus和S. benjamina.寄生于菩提树果内的Schistonchus 线虫,则是还未被描述的线虫种类,这些线虫是植食性线虫,取食植物花部组织,借助传粉榕小蜂转移到新的雌花期隐头果内繁殖.在钝叶榕和豆果榕间花期果内分别发现一种尚未描述的肉食性寄生双胃属线虫(Parasitodplogaster),它们直接取食钝叶榕和豆果榕的传粉榕小蜂,并依赖传粉榕小蜂转移世代繁衍下去.仅在聚果榕里发现2种线虫,植食性和肉食性线虫各一种.在其它雌雄同株的环纹榕、劲直榕、无柄雅榕、曲枝榕、大叶水榕、白肉榕以及硬皮榕7种榕树的隐头果内,目前未发现寄生有线虫.

图 2 裂啮滑刃属和寄生双胃属线虫的形态鉴定特征

注：(a)表示裂啮滑刃属线虫成虫,(b)表示裂啮滑刃属线虫头部内有口针,(c)表示寄生双胃属线虫成虫,(d)表示寄生双胃属线虫头部内无口针.

表 1 西双版纳雌雄同株榕树隐头果内线虫种类

2.3雌雄异株隐头果内寄生线虫的种类及多样性在雌雄异株榕树上,种子和榕小蜂的繁殖在不同树上的隐头果内完成,因此雄树雄花期隐头果内的线虫总能找到传粉榕小蜂雌蜂获得转移到雌花期隐头果内繁殖的机会.雌树隐头果内因没有传粉榕小蜂的存在,发育到花后期隐头果内的线虫不能被传播,繁殖适合度为零.

对处于结果期的18种雌雄异株榕树的间花期果进行抽样,每种榕树分别抽样1～20株树,再从3～200个隐头果内收集线虫.经普查、鉴定,12种榕树的间花期果内寄生有线虫,每种隐头果内有线虫1～3种,而在棒果榕、假斜叶榕、山榕、竹叶榕、光叶楔叶榕以及光叶榕隐头果内目前还未发现线虫.仅在对叶榕和水同木隐头果内发现的裂啮滑刃属3种为已知线虫种类:对叶榕隐头果内发现两种线虫S. centerae和S. guangzhouensis,水同木间花期果内发现一种线虫S. fistulosus.在异形花榕、斜叶榕、歪叶榕和黄毛榕果内均发现一种未描述的裂啮滑刃属线虫;在海南榕、苹果榕、北碚榕、鸡嗉子榕和瘦柄榕隐头果内均发现一种未描述的寄生双胃属线虫.在木瓜榕隐头果内发现了1种裂啮滑刃属线虫和2种寄生双胃属线虫(表2).线虫寄生雄果是成功的选择,但在对叶榕、水同木、海南榕、木瓜榕、北碚榕和苹果榕这6种榕树的雌果内也发现大量线虫,这些线虫缺乏传粉榕小蜂携带传播,繁殖适合度为零.研究结果说明:线虫能准确定位传粉榕小蜂雌蜂,但没法选择雌雄果.

表 2 西双版纳雌雄异株榕树隐头果内线虫种类

注：M代表雄树,F代表雌树.

3 讨论

本研究采用贝曼漏斗法对分布于西双版纳的32种榕树隐头果进行寄生线虫种类普查,包括雌雄同株14种和雌雄异株18种,其中在7种雌雄同株和12种雌雄异株榕树的隐头果内共发现24种寄生线虫,这些线虫分别隶属于植食性的裂啮滑刃属(Schistonchus)和肉食性的寄生双胃属(Parasitodplogaster),其中仅有7种线虫为已知种类[15-20],其余17种是尚待描述的新种.研究结果也展示了裂啮滑刃属和寄生双胃属的线虫的鉴定特征,属级特征前者个体较小,头部内有口针,通常一种隐头果及其传粉榕小蜂互惠系统中寄生有1～3种线虫,并且呈寄主专一性.因此,综合线虫形态特征与专一寄主可以准确鉴定其种类.在雌雄同株隐头果内,种子及榕小蜂同时繁殖,以至寄生其果内的线虫总有机会获得传播,逐代繁衍下去.然而,雌雄异株的隐头果内,种子及榕小蜂繁殖独立于不同树上,本研究雄果和雌果分开抽样,并在6种榕树的雌果内发现有大量线虫,说明线虫准确定位传粉榕小蜂雌蜂离开哺育果后,是随机跟随雌蜂进入雌雄果.繁殖的后代面临两种命运:进入雄果内的繁殖的线虫,有传粉榕小蜂携带传播,可成功获得繁殖机会;而进入雌果内繁殖的线虫由于缺乏榕小蜂携带传播,最终死亡,繁殖适合度为零.因此,深入研究雌雄异株榕树隐头果内寄生线虫的发生和发展规律,有利于更好地揭示榕树-榕小蜂-线虫互作的机理.

已知全球榕树隐头果寄生线虫的研究主要集中在美洲和澳大利亚地区[8,11,14,21-22],中国仅6篇文献对分布于广州市的6种榕树进行了种类调查,描述了隶属于裂啮滑刃属的线虫7种[15-20].本研究是第一次调查西双版纳地区榕树隐头果内寄生线虫种类及多样性,为我国新增了17种隐头果内寄生线虫种类,而且10种隶属于寄生双胃属的线虫在国内是首次报道,丰富了我国及亚洲热带地区榕树隐头果寄生线虫的物种数及多样性.此外,线虫与榕-蜂互惠系统呈专一性关系,说明只有传粉榕小蜂雌蜂是线虫最合适、最可靠的寄主和传播工具[23].然而,线虫要快速、准确找到传粉榕小蜂雌蜂,需要线虫有较强的寄主识别能力,才能准确定位传粉榕小蜂雌蜂,并在对应的隐头果内成功繁殖[9,24].虽然,Gasparrini[10]早在1864年就报道了寄生于雌雄异株无花果内的一种裂啮滑刃线虫(S.caprifici),后来在雌雄异株的对叶榕、水同木隐头果内也相继见寄生线虫的描述,但均未报道其线虫采自雄果还是雌果[17,20].本研究在6种雌雄异株榕树的雌果内发现有大量线虫,说明线虫感染雌雄果是随机、普遍的现象.成功感染隐头果的植食性裂啮滑刃属线虫,取食植物组织发育,最后传粉榕小蜂作为交通工具携带其转移到其它果内繁殖;而寄生双胃属的肉食性线虫直接寄生、取食榕小蜂,因此,线虫的寄生和携带直接或间接地影响到榕树种子及其传粉榕小蜂的繁殖[13,25-26],其影响方式及强度值得进一步观察和研究.

本研究对处于结果期的32种榕树进行抽样,由于部分树结果量少,雌雄异株的榕树雌雄难于同时找到结果树,因此,抽样的树及果量还不够充分,在13种榕树隐头果内还尚未发现线虫寄生,而且大部分有线虫寄生的榕树种类,只发现1种线虫,少见有3种.因此,进一步增加抽样量,在不同榕树结果物候期,适时抽样隐头果,包括雌花期、间花期果,同时也抽样每种榕树专一的传粉榕小蜂所携带线虫情况,并考虑榕树不同分布生境.增加抽样量一方面可以发现更多的隐头果寄生线虫,丰富其物种多样性;另一方面还可以掌握线虫随榕树结果、榕小蜂发育而协同繁殖的机理,以及可深入研究寄生线虫对榕树及传粉榕小蜂互惠系统的影响.

致谢非常感谢仲恺农业工程学院曾永三老师指导线虫分类方法和技术.

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