p-STAT3/5在肝癌中低表达机制的研究*

崔海鹏，张乘云，刘 凯，王爱国，赵 娟△

（1.承德医学院，河北承德 067000；2.大连医科大学）

目前，肝癌的发病机制尚不清楚，其发生发展伴随着多种信号转导机制参与[1]。STAT3/5（signal transducer and activator of transcription，STAT）作为信号传导与转录活化因子，在癌症的发生过程中发挥关键作用。有研究表明，STAT3/5信号通路的持续活化被视为癌症发生的标志[1-3]；但Schneller等的研究发现，Ca-STAT3磷酸化可抑制癌症的发生[4]。为进一步探讨STAT3/5信号通路在肝癌发生过程中的作用机制，本研究利用H-ras 12V转基因肝癌小鼠模型[5]，采用Western blot法检测STAT3/5的活化水平，初步探讨了STAT3/5信号通路在肝癌中的作用机制，以期为肿瘤的临床研究提供一些依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和材料 SPF级雄性H-ras 12V转基因小鼠10只，36周龄，体重25g～30g[大连医科大学SPF实验动物中心，生产许可证SCXK(辽)2015-0003，使用许可证SYXK(辽)2015-0006]。RIPA裂解液（P0013B）、Bradford蛋白浓度测定试剂盒（P0006）、超敏ECL化学发光试剂盒（Cat P0018）均购于碧云天生物技术有限公司，兔抗小鼠p-ERK、p-STAT3、p-STAT5均购于Cell Signaling公司，兔抗小鼠GAPDH抗体、HRP标记山羊抗兔二抗均购于Bioworlde公司。

1.2 方法

1.2.1 样本采集：取材前转基因小鼠空腹过夜，分别取新鲜的肝癌组织和癌旁组织（肿瘤组织周围未发生肝细胞癌的正常肝组织），迅速液氮冷冻保存，以备后续实验。

1.2.2 Western blot检测：RIPA裂解液提取组织样本的总蛋白，Bradford蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量。45μg蛋白于SDS-PAGE胶分离并转膜，p-ERK（1：1000）、p-STAT3（1：1000）、p-STAT5（1：1000）、GAPDH（1：10000）兔抗小鼠一抗4℃孵育过夜。加入HRP标记山羊抗兔二抗(1：5000)，37℃孵育lh，洗膜后用超敏ECL化学发光试剂盒显影。利用Quantity One 4.6.2光密度分析软件对各蛋白目的条带进行分析，以各目的条带灰度值与GAPDH条带灰度值的比值作为各蛋白的相对表达水平。

1.3 统计分析 采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析。计量资料以（±s）表示，Shapiro-Wilk法检验数据符合正态分布，根据Levene方差齐性检验，两组间差异比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

与癌旁组织相比，肝癌组织p-ERK蛋白表达显著升高(P＜0.05)，p-STAT3、p-STAT5蛋白表达水平显著降低(P＜0.05，P＜0.01)。见附图、附表：

附图 转基因小鼠肝癌和癌旁组织p-ERK、p-STAT3、p-STAT5蛋白表达水平

附表 转基因小鼠肝癌和癌旁组织p-ERK、p-STAT3、p-STAT5蛋白表达水平（±s）

附表 转基因小鼠肝癌和癌旁组织p-ERK、p-STAT3、p-STAT5蛋白表达水平（±s）

与癌旁组织比较：*P＜0.05，#P＜0.01

组别 n p-ERK p-STAT3 p-STAT5癌旁组织 10 131.08±20.38 53.55±8.63 301.85±24.03肝癌组织 10 361.95±24.24* 6.48±1.53* 16.79±6.74#

3 讨论

STAT3/5作为信号传导与转录活化因子，可通过自身磷酸化进入到细胞核，参与细胞内信号通路的传导。有研究证实，STAT3/5信号通路可促进细胞增殖、血管生成和细胞存活相关基因转录，并且STAT3/5信号通路持续性活化（磷酸化）被视为癌症发生的标志[2-3]。同时，有研究表明，在人肝癌组织中，p-STAT3表达水平显著升高[1]。赵振军等[6]研究亦发现，人肝癌细胞株伴有STAT5的高表达。但本研究显示，H-ras 12V转基因小鼠肝癌组织p-STAT3、p-STAT5蛋白表达水平显著低于癌旁组织，提示在H-ras 12V转基因小鼠肝癌的发生过程中，STAT3/5信号通路被灭活，STAT3/5信号通路在肝癌发生中可能发挥抑癌作用，与Schneller等的研究结果一致[4]。因此，在不同癌症的发生发展过程中，STAT3/5可能扮演不同角色。

H-ras 12V转基因小鼠是采用转基因技术建立的原发性肝癌疾病动物模型[5]，本研究发现其肝癌组织Ras下游p-ERK蛋白的表达水平显著升高。另有研究发现，Ras/MEK/ERK信号通路可直接激活其下游多条信号通路，促进肝癌的发生、侵袭及转移[7]。基于以上研究，推测在Ras癌基因诱导的肝癌发生过程中，可能是通过某条信号通路降低了STAT3/5的活化水平，但详细分子机制有待进一步阐明。

综上所述，本研究提示肝癌中p-STAT3/5蛋白的表达水平显著降低，可为临床肝癌的诊断提供新的实验数据。

【参考文献】

[1]王林，宋涛，王艳丽，等.p-STAT3在肝细胞肝癌中的表达及临床意义[J].肝癌电子杂志，2014，(2)：40-43.

[2]Liu RY,Zeng Y,Lei Z,et al.JAK/STAT3 signaling is required for TGF-β-induced epithelial- mesenchymal transition in lung cancer cells[J].Int J Oncol,2014,44(5):1643-1651.

[3]Song C,Kim Y,Min GE,et al.Dihydrotestosterone enhances castration-resistant prostate cancer cell proliferation through STAT5 activation via glucocorticoid receptor pathway[J].Prostate, 2014,74(12):1240-1248.

[4]Schneller D,Machat G,Sousek A,et al.p199(ARF)/p14(ARF)controls oncogenic functions of signal transducer and activator of transcription 3 in hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2011, 54(1):164-172.

[5]崔海鹏，董建一，李慧玲，等.Ras/MAPK/ERK通过协同NF-κB促进肝癌细胞中cyclinD1的表达[J].实验动物科学，2014，31(6)：1-6.

[6]赵振军，张丽杰，鹿刚，等.STAT5在人肝癌细胞株SMMC-7721细胞内的表达[J].临床检验杂志，2009，27 (3)：215-216.

[7]Li L,Zhao GD,Shi Z,et al.The Ras/Raf/MEK/ERK signaling pathway and its role in the occurrence and development of HCC[J].Oncol Lett,2016,12(5):3045-3050.