结肠癌患者血清miR-192和miR-23a水平的变化及其临床意义

李晓东，吴钢，刘永军，施立新

（上海市华山北院宝山分院 1. 普通外科 3. 检验科，上海 200431；2. 上海市华山医院 普通外科，上海 200040）

微小RNA（miRNA）是一类非编码的小分子RNA，在肿瘤的发生发展的过程中具有重要作用[1-4]，现已知miR-192是抑癌基因，转染miR-192基因后结肠癌的增殖、侵袭和转移能力明显下降[5]，但miR-192在结肠癌的临床研究方面仍较少报道[6]。miR-23a是一种促癌基因，在结肠癌、胃癌等消化道肿瘤呈高表达，并在肿瘤的发生发展中具有重要作用[7-8]，而miR-23a对结肠癌进行系统的临床研究较少。本组研究通过检测结肠癌患者血清miR-192和miR-23a水平，观察其在结肠癌患者发生发展中的作用，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2011年1月—2015年12月在我院就诊手术的结肠癌患者115例，术前均未行放疗和化疗，均病理确诊为结肠癌。同时选择在我院行手术治疗的腺瘤性息肉的患者45例和在我院行结肠镜检查的健康体检者20例。均排除合并其他部位肿瘤，免疫和血液系统疾病，均知情同意，均在医院伦理委员会通过。115例结肠癌患者中，男50例，女65例；年龄35～70岁，平均年龄（56.94±10.64）岁；大体分型：隆起型23例，浸润型51例和溃疡型41例；浸润深度：侵及浆膜层85例，未及浆膜层30例；肿瘤分化程度：中高分化66例、低分化49例；Dukes分期：A期24例、B期49例、C期31例、D期11例。

1.2 方法

1.2.1 血液标本的抽取 患者入院时和手术2周后空腹取肘静脉血，将标本分别装入干燥试管中。干燥试管中的血液标本予以室温下静置1 h，以3 000r/min的速度，离心5 min，离心半径9 cm，将血清保存在-70 ℃的冰箱中保存待检测。

1.2.2 real time PCR检 测 血 清miR-192和miR-23a 取各组空腹血5 mL放置在真空干燥管中，用2 000r/min的离心速度离心10 min，取血清1 mL加入1 mL TRIzol，混匀后，在4 ℃以1 200r/min离心10 min，取上清液加入0.2 mL的氯仿，静置3 min，在4 ℃以1 200r/min离心15 min，取上清液，加入0.5 mL异丙醇，在-70 ℃静置过夜。第2天，溶解后，4 ℃以1 200r/min离心10 min，去除上清液，用DEPC水配制的75%的乙醇洗1遍，略晾干，加入20 μL DEPC处理过的双蒸水溶解。紫外分光度计测总RNA含量，测定A260及A280值，在1.8～2.1用于检测。各组RNA抽提产物分别取1 μg RNA用反转录试剂盒进行反转录得到cDNA，具体添加量。将样品彻底混合均匀，短暂离心，37 ℃孵育60 min。逆转录产物-20℃保存。根据目标基因的imRNA序列，按照引物设计的原则，用设计软件primer express 3.0设计并合成qPCR检测引物及探针，miR-192上游引物：5'-GGG GCT GAC CTA TGA ATT GA-3'和下游引物5'-CAG TGC AGG GTC CGA GGT-3'；miR-23a的上游引物：5'-GGG GAT CAC ATT GCC AGG-3'和下游引物5'-AGT GCG TGT CGT GGA GTC-3'；U6的上游引物：5'-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T-3'和下游引物5'-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3'。目标基因探针和内参基因探针均为5'端采用FAM报告荧光标记，3'端采用TAMRA淬灭荧光标记。取2 µg中RNA加入内参U6和目的小分子RNA miR-192和miR-23a逆转录引物，在70 ℃反应10 min，后取出立即冰育2 min，随后加入其他试剂。其反应程序为：42 ℃反应60 min，70 ℃反应10 min。立即将cDNA产物取出，快速置冰上冷却-80 ℃以备后用。以逆转录产物为模板，在实时定量PCR仪上进行扩增，其反应条件为：在95 ℃反应3 min，起到起始模板变性；在95 ℃反应15 s，PCR循环中模板变性，然后60 ℃中反应45 s起到退火的作用，循环35次。采用相对定量的方法对miRNA进行相对量表达进行计算，以2-△△CT表示目的基因相对于配对正常标本的变化倍数，其中△CT=CTimRNA-CTU6，△△ CT=△ CTimRNA-△CT对照组。

1.2.3 观察指标 观察结肠癌、结肠良性息肉和健康对照组的miR-192和miR-23a表达水平变化，并观察结肠癌患者血清miR-192和miR-23a表达水平与临床病理指标的关系，手术后其水平的变化及其相关性。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0软件包对数据进行统计分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组正态分布资料采用方差分析，各组之间的比较采用q检验，独立因素的两组比较采用t检验，治疗前后比较采用配对t检验。两个变量连续正态数据采用Pearson法进行相关性分析，计数资料采用率表示，检验采用χ2检验，P＜0.05视为差异有统计学意义，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 各组血清miR-192和miR-23a水平

健康对照组血清miR-192的相对量为3.15±1.06，腺瘤性息肉组为1.39±0.68，结肠癌组为0.78±0.25，3组比较差异有统计学意义（F=283.714，P＜0.05），结肠癌患者血清miR-192水平明显低于良性息肉组和健康对照组（均P＜0.05）；健康对照组血清miR-23a的相对量为0.98±0.24，良性息肉组为1.28±0.65，结肠癌组为3.48±1.06，3组比较差异有统计学意义（F=187.250，P＜0.05），结肠癌患者血清miR-23a水平明显高于良性息肉组和健康对照组（均P＜0.01）。

手术后结肠癌患者血清miR-192相对量为2.48±0.96，较手术前明显升高（t=18.377，P＜0.05）；而术后结肠癌患者miR-23a的相对量为1.16±0.76，较术前明显降低（t=19.075，P＜0.05）（图1）。

2.2 结肠癌患者血清miR-192和miR-23a水平与临床病理因素的关系

结肠癌患者术前血清miR-192和miR-23a水平与年龄，性别，肿瘤直径，大体分型，浸润深度，脉管浸润，神经浸润和CEA水平无关（均P＞0.05），与肿瘤分化程度、淋巴转移、Dukes分期具有关（均P＜0.05）（表1）（图2）。

2.3 结肠癌患者血清miR-192和miR-23a的相关性

相关性分析结果显示，结肠癌患者血清miR-192水平与miR-23a水平呈负相关（r=-0.747，P＜0.05）（图3）。

图1 结肠癌患者手术前后RT-PCR检测情况 A：融解曲线；B：术前扩增曲线；C：术后扩增曲线

表1 血清miR-192和miR-23a水平与结肠癌临床病理因素的关系

表1 血清miR-192和miR-23a水平与结肠癌临床病理因素的关系（续）

图2 结肠癌不同肿瘤分化程度，淋巴转移和Dukes分期的箱线图

图3 结肠癌患者血清miR-192水平与miR-23a水平的相关性

3 讨 论

miR-192基因为人体的11号染色体，主要在肝脏，肾脏和结肠等组织中表达，在结肠癌，肝癌和肺癌等恶性肿瘤中miR-192表达水平明显降低，被认为是肿瘤抑制性miRNA[9-11]。有研究[12]表明miR-192可以通过调节细胞的生长，细胞周期及凋亡等生物学行为，其差异性表达可以作为临床恶性肿瘤的早期诊断，分期，转移和预后等重要指标，miR-192可以靶向性抑制二氢叶酸还原酶，从而控制细胞周期；同时研究已经证实多种G1和G2周期检查的关键蛋白的编码基因是miR-192的靶基因，机体可以通过上调miR-192基因的表达，引起细胞周期G1和G2期阻滞。在基因芯片研究显示miR-192有62个基因表达出现下调，其中8个基因参与细胞周期，被证实为miR-192的直接靶点[13]。本组研究表明结肠癌患者血清的miR-192水平明显低于结肠息肉和健康体检者，手术后结肠癌患者血清miR-192水平出现明显升高，说明机体下调miR-192水平与结肠癌的发生发展具有明显的关系，去除结肠癌原发病后，机体的微环境得到改善，从而机体的miR-192水平出现明显的升高。本组研究还表明结肠癌患者血清miR-192水平与结肠癌分期、分化程度、淋巴结有无转移有关，说明基因miR-192表达与结肠癌患者的转移，分化程度和恶性程度均有一定的联系，可能参与了结肠癌的进展过程。

miR-23a是miR-23的一种亚型，近期的研究[14]表明miR-23a参与了细胞发育的各个阶段，包括增殖、凋亡和变异等。其在肿瘤的发生发展具有显著的联系，一般扮演着致癌基因的角色，在结直肠癌，前列腺癌等肿瘤表达明显上调，促进肿瘤细胞的转移[15-16]。有研究[17-18]表明miR-23a直接通靶向性抑制转移抑制因子1蛋白，从而促进结肠癌细胞的增殖、侵袭和转移。并有研究[19-20]表明miR-23a表达的上调与结肠癌分期的升高，浸润深度增加和肠道黏膜恶性转化具有明显的相关性，miR-23a可以通过促进细胞上皮细胞间充质转化，促进肿瘤细胞的转移，是结肠癌转移浸润的重要生物学指标。本组研究表明血清miR-23a水平在结肠癌患者明显强于结肠息肉和健康体检者，并且手术后结肠癌患者血清的miR-23a水平明显降低，说明miR-23a表达增加与结肠癌的发生发展具有明显的相关性，去除癌症的微环境机体的miR-23a表达水平出现明显降低。本研究还发现结肠癌患者血清miR-23a水平与肿瘤分期、分化程度、淋巴结转移有关，说明miR-23a基因调控可能与结肠癌的侵袭和转移具有一定的联系。本组研究还表明结肠癌的miR-192水平与miR-23a水平呈负相关，miR-192在此研究中为抑癌基因，而miR-23a为促癌基因，两者的联系是否直接联系或者通过其他基因发生联系上不清楚，需要在将来进一步研究。

总之，本研究结果提示，血清miR-192和miR-23a水平的变化在结肠癌的发生发展过程中可能具有重要作用，两者有望作为结肠癌的重要肿瘤标记物。

[1] Pradhan M, Nagulapalli K, Ledford L, et al. A system biology approach for understanding the miRNA regulatory network in colon rectal cancer[J]. Int J Data Min Bioinform, 2015, 11(1):1–30.

[2] Li C, Xu N, Li YQ, et al. Inhibition of SW620 human colon cancer cells by upregulating miRNA-145[J]. World J Gastroenterol, 2016,22(9):2771–2778.

[3] 张立, 张迪, 李孝彬, 等. microRNA-616在肝癌中的表达及临床意义[J]. 中国普通外科杂志, 2016, 25(7):991–997.Zhang L, Zhang D, Li XB, et al. Expression of microRNA-616 in hepatocellular carcinoma and its clinical significance[J]. Chinese Journal of General Surgery, 2016, 25(7):991–997.

[4] 姜训圳, 赵科, 何向辉. miRNA-21、miRNA-135b、miRNA-141在结肠癌中的表达及其意义[J]. 中国普通外科杂志, 2014,23(10):1367–1372.Jiang XZ, Zhao K, He XH. Expressions of miRNA-21, miRNA-135b and miR-141 in colon cancer and the significance[J]. Chinese Journal of General Surgery, 2014, 23(10):1367–1372.

[5] 吴巍芸, 周宇. miR-192与ZEB2在结直肠癌中的表达及其临床意义[J]. 中国癌症杂志, 2014, 24(7):507–511.Wu WY, Zhou Y. The expression and clinical signiifcance of microRNA-192 and ZEB2 in colorectal cancer[J]. China Oncology,2014, 24(7):507–511.

[6] 高阳, 尚闯, 罗淼. 微小RNA-192在Ⅱ、Ⅲ期结直肠癌组织中表达及其与术后复发转移的关系[J]. 中华实验外科杂志, 2015,32(8):1989–1992.Gao Y, Shang C, Luo M. Expression of microRNA - 192 in Ⅱ-and III-stage colorectal cancer tissues and its relationship with postoperative recurrence and metastasis[J]. Chinese Journal of Experimental Surgery, 2015, 32(8):1989–1992.

[7] Yong FL, Wang CW, Roslani AC, et al. The involvement of miR-23a/APAF1 regulation axis in colorectal cancer[J]. Int J Mol Sci,2014,15(7):11713–11729.

[8] Liu X, Liu Q, Fan Y, et al. Downregulation of PPP2R5E expression by miR-23a suppresses apoptosis to facilitate the growth of gastric cancer cells[J]. FEBS Lett, 2014, 588(17):3160–3169.

[9] 熊真. 胃癌组织中 miRNAs 及下游靶基因表达量分析及其与临床病理分期的关系探究[J]. 海南医学院学报, 2016, 22(8):732–735.Xiong Z. Analysis of expression of miRNAs and downstream target genes in gastric cancer tissue and exploration of its relationship with clinicopathologic stage[J]. Journal of Hainan Medical College,2016, 22(8):732–735.

[10] 张永锋, 郭长军, 谭永港, 等. 溃疡性结肠炎相关性结肠癌差异表达的miRNA的筛选研究[J]. 中国中西医结合消化杂志, 2014,22(2):65–68.Zhang YF, Guo CJ, Tan YG, et al. Screening of differentially expressed miRNA in ulcerative colitis related colorectal cancer[J].Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine on Digestion, 2014, 22(2):65–68.

[11] 谢琼慧, 何星星, 常莹, 等. 乙型肝炎病毒X基因下调miR-192对人肝癌细胞株HepG2凋亡的影响[J]. 中华肝脏病杂志, 2011,19(11):857–860.Xie QH, He XX, Chang Y, et al. HBx gene down-regulates miR-192 expression and inhibits apoptosis of human hepatoma cell line HepG2[J]. Chinese Journal of Hepatology, 2011, 19(11):857–860.

[12] Ye M, Zhang J, Zhang J, et al. Curcumin promotes apoptosis by activating the p53-miR-192–5p/215-XIAP pathway in non-small cell lung cancer[J]. Cancer Lett, 2015, 357(1):196–205.

[13] 张晶, 赵晨燕, 刘清华, 等. 胰腺导管腺癌microRNA表达谱的研究[J]. 中华胰腺病杂志, 2012, 12(5):313–316.Zhang J, Zhao CY, Liu QH, et al. MicroRNA profiles in pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Chinese Journal of Pancreatology, 2012,12(5):313–316.

[14] 李杰, 刘惟优, 袁小亮, 等. miR-23a对肺腺癌细胞95-D迁移和侵袭能力的影响[J]. 实用医学杂志, 2014, 30(1):43–46.Li J, Liu WY, Yuan XL, et al. Effect of miR-23a on migration and invasion in lung adenocarcinoma 95-D cells[J]. The Journal of Practical Medicine, 2014, 30(1):43–46.

[15] Yong FL, Law CW, Wang CW. Potentiality of a triple microRNA classifier: miR-193a-3p, miR-23a and miR-338–5p for early detection of colorectal cancer[J]. BMC Cancer, 2013, 13:280. doi:10.1186/1471–2407–13–280.

[16] Aghaee-Bakhtiari SH, Arefian E, Naderi M, et al. MAPK and JAK/STAT pathways targeted by miR-23a and miR-23b in prostate cancer: computational and in vitro approaches[J]. Tumour Biol,2015, 36(6):4203–4212.

[17] Zheng H, Li W, Wang Y, et al. miR-23a inhibits E-cadherin expression and is regulated by AP-1 and NFAT4 complex during Fas-induced EMT in gastrointestinal cancer[J]. Carcinogenesis,2014, 35(1):173–183.

[18] 陈力, 王梅梅, 周洪霞, 等. MiR-23a质粒的构建及其在胃腺癌细胞系MGC803中的表达[J]. 中国现代医学杂志, 2014, 24(20):16–22.Chen L, Wang MM, Zhou HX, et al. Construction of the vector of miR-23a and expression in gastric adenocarcinoma cell line MGC803[J]. China Journal of Modern Medicine, 2014, 24(20):16–22.

[19] 唐海林, 邓敏, 廖前进, 等. miR-23a与转移抑制因子1在结肠癌中的表达及其临床意义[J]. 中华病理学杂志, 2012, 41(1):28–32.Tang HL, Deng M, Liao QJ, et al. Expression and clinical significance of miR-23a and metastasis suppressor 1 in colon carcinoma[J]. Chinese Journal of Pathology, 2012, 41(1):28–32.

[20] Wen YC, Lee WJ, Tan P, et al. By inhibiting snail signaling and miR-23a-3p, osthole suppresses the EMT-mediated metastatic ability in prostate cancer[J]. Oncotarget, 2015, 6(25):21120–21136.