家兔源致病性维罗纳气单胞菌的分离鉴定及药敏试验

周 军，任永军，汤 承

(1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.四川省畜牧科学研究院动物遗传育种四川省重点实验室，四川 成都 610066)

维罗纳气单胞菌(Aeromonas veronii)，属弧菌科气单胞菌属[1].其广泛分布于有水环境中[2]，是畜禽肉品、水产品和蔬菜的重要污染源.该菌能感染人，引起腹泻[3]、菌血症[4]、脓毒症[5]、呼吸道感染[6]等，给人类健康造成威胁.报道显示，维罗纳气单胞菌可引起多种鱼类致病[7-15]，给水产养殖业带来了巨大的损失；此外，2012年李伟杰等[16]从病死的狐狸病变肝脏组织中分离到该菌，并证明该菌有致病性.维罗纳气单胞菌致病菌株多为温和生物型[17-18].其作为一种较为新型的人-兽-鱼共患病原菌，备受关注，但未见引起家兔致病的报道.

2017年3月，四川某兔场家兔出现咳嗽、打喷嚏和流鼻液等呼吸道症状，该兔场基础母兔存栏量为2600只，发病率约为20%，从发病至样本采集的半个月时间里，家兔没有出现死亡.病兔剖检主要见肺脏有出血点和纤维性渗出物.为调查其病因，本试验无菌采集病兔肺脏进行细菌分离和鉴定，并对分离菌进行药敏试验，旨在为兔呼吸道疾病的防控提供依据.

1 材料与方法

1.1 临床样本、实验动物及质控菌株

随机取5只病兔和5只临床健康兔，送四川省高等学校重点实验室待检.实验动物为昆明系小鼠(20～22 g，雌性)购自成都达硕实验动物有限公司；药敏试验质控菌株为大肠杆菌ATCC25922，由本实验室保存.

1.2 培养基及试剂

胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)、胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)和全血琼脂平板均购自青岛高科园海博生物技术有限公司；细菌16S rDNA通用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；核酸提取、Taq酶等均购自大连TaKaRa公司；马血清购自郑州佰安生物工程有限公司；药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司.

1.3 病兔肺脏组织的细菌分离

对送检的10只家兔均用乙醚麻醉后放血处死，无菌采集10只家兔的肺脏划线接种于血琼脂平板上，37℃培养12～24 h；挑取形态一致的单菌落转接于含5%马血清TSA进行纯培养.观察分离菌在血琼脂平板上和TSA上的菌落特征，并进行革兰氏染色镜检，观察镜检形态.

1.4 分离菌的16S rDNA序列PCR扩增及测序鉴定

采用文献[19]报道的细菌16s rDNA的通用引物27F/1492R进行PCR扩增，PCR反应体系:PCR-MIX 12.5 μL，上、下游引物各 1 μL，ddH2O 8.5 μL，DNA模板 2 μL，共 25 μL.PCR 反应条件:95 ℃ 预变性5 min；95 ℃变性35 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共完成40个循环；最后72℃，延伸8 min后结束PCR扩增.将PCR扩增产物凝胶电泳检测，并送上海生工测序.

1.5 分离菌的16S rDNA序列进化分析

在NCBI上用BLAST将测序获得的维罗纳气单胞菌序列同GenBank数据库中收录的维罗纳气单胞菌序列进行同源性比对，并从GenBank中下载了17条不同国家或地区、不同宿主、不同时间的维罗纳气单胞菌序列，运用Mega6.0软件构建系统发育树.

1.6 分离菌对小鼠的致病性试验

将分离的4株维罗纳气单胞菌接种于TSB中，37℃、150 r/min空气浴振摇培养12 h，将4株菌培养物分别腹腔注射5只小鼠，注射剂量为0.2 mL/只，空白对照腹腔注射TSB，观察各分离菌对小鼠的致病性.

1.7 药敏试验

按照世界卫生组织(WHO)推荐的K-B纸片法对4株维罗纳气单胞菌进行药敏试验.用接种环挑取纯化的单菌落接种于TSB培养基中，37℃、150 r/min空气浴振摇培养12 h，将培养后的菌液稀释至终浓度为1.5×108CFU/mL，取1mL菌液均匀涂布于TSA平板上，待菌液吸收后贴上药敏纸片，37℃恒温培养12 h.按照NCCLS 2009年标准，以耐药、中敏、敏感判定药敏试验结果.

2 结果

2.1 细菌分离情况

从5只病兔肺脏中分离到4株细菌，在TSA平板和血琼脂平板上生长旺盛，均呈边缘整齐、光滑、中间隆起的灰白色菌落；在血琼脂平板上产生β溶血(见图1)；革兰染色均为G-短杆菌，两端钝圆，且多呈单个排列(见图2).而外表健康家兔的肺脏中未分离到细菌.

图1 分离菌株菌落特征Fig.1 Thecolony characteristics of isolates

图2 分离菌株革兰氏染色镜检Fig.2 Gram stains ofisolates

2.2 分离菌16S rDNA PCR扩增结果及同源性比对结果

分离菌16S rDNA PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，可见1500 bp左右的特异性条带(见图3)，与预期目的片段大小相符.PCR产物测序结果与Gen-Bank数据库比对，与维罗纳气单胞菌同源性为99.1%～100%.

图3 分离菌株16S rDNA基因PCR扩增电泳图M:DL2000标准分子质量；1～4:4个分离菌株Fig.3 16SrDNA PCR amplification results of isolatesM:DL2000 DNA Maker；1 ～ 4:PCR amplification products of four bacterial isolates

2.3 分离菌系统进化分析

系统进化分析显示(见图4)，维罗纳气单胞菌聚为2 个大支，4 株分离株(编号为 1-1、2-1、3-1、5-1)与GenBank中登录的KC633849.1等15株中国分离株聚为一支.

图4 维罗纳气单胞菌16s rDNA基因片段的邻近法进化树Fig.4 Neighbor-joining consensus tree for partial 16SrDNA gene fragment of Aeromonas veronii

2.4 分离菌对昆明小鼠的致病性

4株家兔源维罗纳气单胞菌分别腹腔注射小鼠后，均在注射菌后7～8 h左右发病，小鼠出现精神不振，扎堆等现象.注射菌后12～24 h病情加重，小鼠表现出弓背、运动迟缓、食欲不振、精神沉郁、呼吸轻微急促等症状.注射菌后24～48 h 4株维罗纳气单胞菌对小鼠的致死率分别为1/5、2/5、2/5、3/5，剖解见肺脏出血.48 h后没有死亡的小鼠精神、食欲等均好转，出现耐过现象，对照组小鼠没有发病和死亡，说明4株分离菌对试验昆明小鼠均有一定的致病性.

2.5 药敏试验结果

对4株维罗纳气单胞菌运用临床常用的21种抗菌类药物进行药物敏感性试验，结果见表1，4株分离菌均对头孢噻肟、头孢他啶、头孢呋辛、头孢唑啉、左氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、四环素、多西环素、氟苯尼考、哌拉西林敏感，部分分离株对氨苄西林、阿莫西林、链霉素、妥布霉素、阿米卡星、新霉素、多粘菌素B耐药.

表1 4株维罗纳气单胞菌的药物敏感性结果Table 1 Drug sensitivity results of fourAeromonas veronii isolates

3 讨论

本试验首次从家兔肺脏分离得到维罗纳气单胞菌，并证明其对昆明小鼠有致病性.维罗纳气单胞菌作为一种较为新型的人-兽-鱼共患病呼吸道病原菌，具有一定的公共卫生学意义，应加强其防范.目前我国的家兔养殖方式正向着集约化和规模化转变，饲养方式的变化，导致一些条件性致病菌的感染发病增加.家兔呼吸道疾病临床症状多表现为流黏液性或脓性鼻涕，打喷嚏，呼吸困难等.其病因复杂，常见的感染因素有致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌 、金黄色葡萄球菌和支气管败血波氏杆菌等[20].本试验从患病家兔肺脏分离到4株维罗纳气单胞菌，虽然维罗纳气单胞菌不是家兔呼吸道常见病原菌，但研究发现其对试验动物昆明小鼠具有一定的致病力.结合临床症状和细菌分离结果，引起该家兔养殖场本次发生呼吸道疾病的病原菌为维罗纳气单胞菌.

抗生素是治疗细菌性疾病的主要措施，从目前国内外对维罗纳气单胞菌研究报道可知，不同地区、不同动物来源的维罗纳气单胞菌的耐药性不尽相同[7-15].本研究分离的4株维罗纳气单胞菌均对头孢噻肟、头孢他啶、头孢呋辛、头孢唑啉、左氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、加替沙星、四环素、多西环素、氟苯尼考、哌拉西林等12种药物敏感，部分分离株对氨苄西林、阿莫西林、链霉素、妥布霉素、阿米卡星、新霉素、多粘菌素B等7种药物耐药.该兔场通过选用敏感药物进行治疗，其呼吸道疾病得到了控制.

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