IRX1、IRX2基因在原发性肝癌组织细胞中的表达及其对肝癌细胞的免疫保护作用

刘良田 许海涛 唐永华

原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一, 我国每年死于肝癌的患者超过11万, 已占我国肿瘤死因的第2位［1］。有资料表明, IRX1、IRX2与肝癌细胞发展相关［2］。本次研究分析肝癌细胞中IR X1、IRX2表达情况, 观察其对细胞免疫功能的影响, 以期为肝癌的治疗提供一个新的方向。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 标本来源 选择本院和光明新区等医院2014年2月～2017年8月收治的60例进行HCC手术患者的新鲜标本作为研究对象, 所有患者术前均未接受放化疗。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 60例HCC标本均取癌组织、癌旁组织和远癌肝组织,肉眼观距肿瘤边界2 cm以内的非癌组织为癌旁组织, 2 cm以上为远癌肝组织。所有标本离体后立即取0.5 cm×0.5 cm 大小的组织块, 迅速置于液氮罐中, 于-80℃低温冰箱内保存, 以备检测。

1.2.2 临床资料收集 收集患者性别、年龄、肿瘤大小、是否包膜、肿瘤分化程度、有无镜下脉管癌栓、复发情况、甲胎蛋白(AFP)、是否合并乙肝或淋巴结转移、是否有肝硬化、TNM分期、术后生存时间。

1.2.3 SP法检测 根据SP检测说明书按照步骤进行操作, 结果判断：染色后的切片采取双盲的方法, 由两位病理医师根据染色的强度和阳性细胞的百分比, 独立进行半定量评分(HSCORE), 若切片 HSCORE＞100 判断为阳性,HSCORE≤100 判断为阴性。

1.2.4 RT-PCR检测 ①总RNA的提取：采用Simply P总RNA提取试剂盒说明书提取两种细胞的总RNA。②互补脱氧核糖核酸(cDNA)的合成：按照cDNA合成说明书进行。③PCR反应及凝胶电泳：根据说明书进行。

1.3 检测标本及指标

1.3.1 肝癌及癌旁组织检测 以60例肝癌组织和60例癌旁组织为研究对象, 采用RT-PCR法检测IRX1、IRX2mRNA表达情况, 采用SP法检测IRX1、IRX2蛋白表达情况。

1.3.2 肝癌组织检测 以60例肝癌组织为研究对象, 采用SP法检测IRX1、IRX2蛋白表达情况, 并将60例肝癌组织按照病理分期分为高分化组21例、中分化组20例、低分化组19例, 比较其IRX1、IRX2蛋白表达差异。

1.4 载体构建及转染 将人肝癌细胞分为IRX1高表达组、IRX2高表达组、IRX1正常表达组及IRX2正常表达组四组,采用载体构建及转染的方式将IRX1、IRX2基因注入人肝癌细胞中, 使用细胞增殖 MTT法检测SMMC-7721细胞, 在酶联仪(Biorad M-550)上测定490 nm波长处的吸光值, 使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况和周期变化。

1.5 统计学方法 采用SPSS16.0统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s), 采用t检验；计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验；采用趋势卡方检验和秩和检验分析蛋白表达数据与临床病理特征间的关系。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌及癌旁组织检测

2.1.1 IRX1、IRX2 mRNA表达 mRNA表达结果显示, 肝癌组织中IRX1 mRNA表达量为(13.81±3.29)明显高于癌旁组织的(6.52±2.84), 差异具有统计学意义(P＜0.05)。肝癌组织中IRX2 mRNA表达量为(4.62±1.83)明显低于癌旁组织的(9.37±2.59), 差异具有统计学意义(P＜0.05)。

2.1.2 IRX1、IRX2蛋白表达 肝癌组织中的IRX1蛋白阳性表达例数显著多于癌旁组织, IRX2蛋白阳性表达例数少于癌旁组织, 差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 肺癌及癌旁组织IRX1、IRX2蛋白表达情况(n)

2.2 肝癌组织检测 IRX1基因表达程度与肿瘤分化程度呈负相关, IRX2基因表达程度与肿瘤分化程度呈正相关。见表2。

表2 三组肝癌组织IRX1、IRX2表达情况(n)

2.3 IRX1、IRX2不同表达组细胞增殖变化 IRX1高表达组37例, IRX1正常表达组14例, IRX2高表达组24例,IRX2正常表达组27例。MTT检测后IRX1高表达组A490显著低于IRX1正常表达组, IRX2高表达组A490显著高于IRX2正常表达组, 差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

表3 IRX1、IRX2不同表达组细胞增殖变化( ±s)

表3 IRX1、IRX2不同表达组细胞增殖变化( ±s)

注：与相同基因正常表达组比较, aP＜0.05

24 h 48 h IRX1高表达组 37 0.68±0.07a 0.57±0.05a IRX1正常表达组 14 0.83±0.09 0.74±0.08 IRX2高表达组 24 0.84±0.10a 0.76±0.08a IRX2正常表达组 27 0.66±0.06 0.59±0.06组别 例数A490

2.4 IRX1、IRX2不同表达组细胞凋亡变化 IRX1高表达组细胞凋亡总比例显著高于IRX1正常表达组, IRX2高表达组细胞凋亡总比例显著低于IRX2正常表达组, 差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表4。

表4 IRX1、IRX2不同表达组细胞凋亡变化( ±s)

表4 IRX1、IRX2不同表达组细胞凋亡变化( ±s)

注：与相同基因正常表达组比较, aP＜0.05

24 h 48 h IRX1高表达组 37 66.48±6.27a 57.51±5.35a IRX1正常表达组 14 50.83±5.26 42.74±4.18 IRX2高表达组 24 52.39±5.43a 41.39±4.11a IRX2正常表达组 27 61.74±6.10 50.86±5.25组别 例数 凋亡总比例(%)

2.5 IRX1、IRX2不同表达组细胞周期变化 IRX1高表达组G0/G1、G2/M期显著低于IRX1正常表达组, S期显著高于IRX1正常表达组；IRX2高表达组G0/G1、G2/M期显著高于IRX2正常表达组, S期显著低于IRX2正常表达组, 差异均具有统计学意义(P＜0.05)。见表5。

表5 IRX1、IRX2不同表达组细胞周期变化( ±s)

表5 IRX1、IRX2不同表达组细胞周期变化( ±s)

注：与相同基因正常表达组比较, aP＜0.05

组别 例数 G0/G1 S G2/M IRX1 高表达组 37 74.35±5.82a 18.63±1.37a 0.27±0.03a IRX1正常表达组 14 80.21±6.57 17.35±1.12 1.31±0.15 IRX2 高表达组 24 81.03±6.62a 17.42±1.15a 1.33±0.17a IRX2正常表达组 27 73.29±5.76 18.71±1.38 0.31±0.04

3 讨论

IRX1、IRX2基因属易洛魁家族同源盒基因, 是一簇与胚胎发育密切相关的基因, 编码参与神经系统发育的具有转录因子组合活性的家族蛋白［3］。Rapidis等［4］研究发现, 头颈癌细胞株过表达IRX1基因后, 细胞增殖和体外形成能力降低。IRX1 基因参与胃癌的发生发展, 在人胃癌细胞系及胃癌动物模型中过表达, IRX1 基因可抑制胃癌细胞增殖、凋亡、死亡、侵袭、迁移及小鼠皮下成瘤能力［5］。余爽等［6］研究中发现HCC组织中IRX2的表达水平低于癌旁组织, IRX2的异常表达与HCC的分化程度有关。大量研究表明, IRX基因在肿瘤的发生发展过程中具有重要意义［7-10］。

为探讨IRX1、IRX2基因在HCC组织细胞中的表达及其对肝癌细胞的免疫保护作用, 本次研究将60例HCC手术新鲜标本作为研究对象, 结果显示, 原发性肝癌组织细胞中IRX1的mRNA表达量明显高于癌旁组织, IRX2mRNA表达量明显低于癌旁组织, 差异具有统计学意义(P＜0.05)。IRX1与IRX2在肝癌组织中的阳性表达例数显著多于癌旁组织,差异具有统计学意义(P＜0.05)；IRX1基因表达程度与肿瘤分化程度呈负相关, IRX2基因表达程度与肿瘤分化程度呈正相关。IRX1高表达组37例, IRX1正常表达组14例, IRX2高表达组24例, IRX2正常表达组27例。MTT检测后IRX1高表达组A490显著低于IRX1正常表达组, IRX2高表达组A490显著高于IRX2正常表达组, 差异具有统计学意义(P＜0.05)。表明IRX1高表达可以抑制癌细胞增殖, IRX2高表达会促进癌细胞增殖。IRX1高表达组细胞凋亡总比例显著高于IRX1正常表达组, IRX2高表达组细胞凋亡总比例显著低于IRX2正常表达组。表明IRX1高表达能够促进癌细胞凋亡, 而IRX2高表达会减缓癌细胞凋亡。IRX1高表达组G0/G1、G2/M期显著低于IRX1正常表达组, S期显著高于IRX1正常表达组, 差异具有统计学意义(P＜0.05)；IRX2高表达组G0/G1、G2/M期显著高于IRX2正常表达组, S期显著低于IRX2正常表达组, 差异具有统计学意义(P＜0.05)。表明IRX1高表达会使癌细胞G0/G1、G2/M期阻滞, S期延长, 提示癌细胞周期进程减缓, 生殖受到抑制；IRX1高表达会使癌细胞G0/G1、G2/M期延长, S期阻滞, 提示癌细胞周期进程加快, 促进生殖。

综上所述, IRX1基因表达程度与肿瘤分化程度呈负相关, IRX2基因表达程度与肿瘤分化程度呈正相关；IRX1基因高表达能够抑制癌细胞生长增殖, 促进其凋亡, IRX2基因高表达能够促进癌细胞生长增殖, 减缓其凋亡；两者均是肝癌细胞发展变化的重要指标。但本研究尚未探究清楚IRX1、IRX2基因抑制或促进细胞增殖、凋亡、介导周期停滞机制,还需进行更加深入的研究。

［1］ Zhao R, Wu Y, Wang T, et al.Elevated Src expression associated with hepatocellular carcinoma metastasis in northern Chinese patients.Oncol Lett, 2015 , 10(5):3026-3034.

［2］ 周薇, 赵龙凤, 徐恩伟.同源盒基因家族与肿瘤关系的研究进展.中国药物与临床, 2016, 16(4):532-535.

［3］ 张鹏幸, 曾伟涛, 刘辉, 等.易洛魁家族同源盒基因IRX1在胶质瘤中的表达研究.现代生物医学进展, 2017, 17(7):1229-1232.

［4］ Rapidis AD, Wolf GT.Immunotherapy of head and neck cancer:current and future considerations.Journal of Oncology, 2009,2009(3):346345.

［5］ Guo X, Liu W, Pan Y, et al.Homeobox gene IRX1 is a tumor suppressor gene in gastric carcinoma.Oncogene, 2010, 29(27):3908.

［6］ 余爽, 王静, 董冰, 等.IRX2基因在原发性肝癌中表达的初步研究.解放军医学杂志, 2013, 38(3):185-189.

［7］ 王斌, 张逊.同源盒基因与肿瘤的研究进展.医学综述, 2017,23(7):1329-1333.

［8］ Lu J, Song G, Tang Q, et al.IRX1 hypomethylation promotes osteosarcoma metastasis via induction of CXCL14/NF-κB signaling.Journal of Clinical Investigation, 2015, 125(5):1839.

［9］ 杨惠洁.IRX1基因在原发性肝癌中的表达研究.重庆医科大学, 2012.

［10］ 许海涛, 刘良田, 唐永华, 等.同源基因IRX1在原发性肝癌中的表达及其临床意义.中国当代医药, 2017, 24(14):4-6.