葫芦素I对肝癌细胞生长的抑制作用及其与STAT3通路相关抗凋亡因子的关系

王成志，彭元亮，史夏青，周晓庆，杨满意，赵劲风，廖明媚

（中南大学湘雅医院 1. 卫生部纳米生物技术重点实验室 3. 神经内科，湖南 长沙 410008；2. 中南大学生命科学学院，湖南 长沙 410078）

肝癌是世界上第六大癌症，肿瘤致死率排名第二[1]。晚期肝癌的治疗仍是一个世界性难题，化疗虽可延长晚期肝癌患者的生存期，但毒副作用较大，分子靶向治疗具有无限前景，找到靶向治疗的肝癌药物迫在眉睫。

葫芦素I（cucurbitacin I）又名JSI-124，是从葫芦科植物中提取出来的三萜甾醇类物质[2]，最近的研究表明葫芦素I具有潜在的抗癌效果，能引起胶质母细胞瘤[3]、乳腺癌[4]、骨肉瘤[5]及肝癌[6]等肿瘤细胞发生凋亡，而葫芦素I引起肿瘤细胞凋亡的分子机制复杂。在乳腺癌[4]和骨肉瘤[5]中，葫芦素I抑制信号转导子与转录因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的激活，抑制细胞侵袭和转移。在肝癌中，葫芦素I激活P53信号[6]，上调促凋亡蛋白Fas及Bax的表达引起细胞凋亡。葫芦素I还能通过抑制血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）、成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）和p-STAT3抑制细胞增殖和血管生成[7-8]。葫芦素I还能激活NF-κB信号通路[3]，引起IL-6、IL-8和SOCS3的表达升高。然而其对肝癌的作用和机制目前尚不完全明确，本研究拟探讨葫芦素I对肝癌的作用及其潜在的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人肝癌细胞HepG2、QGY-7703、SMMC-7721均来自本实验室冻存。葫芦素I购自Sigma公司，STAT3、磷酸化STAT3（p-STAT3）、髓样细胞白血病1（myeloid cell leukemia 1，Mcl-1）、survivin、GAPDH一抗和二抗购自Cell Signaling Technology公司。CCK-8试剂盒购买自同仁化学公司，TRIzol购买自Invitrogen公司，逆转录试剂盒购买自东洋纺公司，SYBR Green染料购买自Biotool公司，细胞周期检测试剂盒购买自美国BD公司，Hochest 33342购买自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 肝癌细胞（HepG2、QGY-7703、SMMC-7721）培养于10%胎牛血清，1%青霉素和链霉素，37 ℃，5%CO2，DMEM培养基中。

1.2.2 CCK-8法检测细胞活力将肝癌细胞（HepG2、QGY-7703、SMMC-7721）接种于96孔板，每孔8 000个细胞，每组5个复孔，待细胞贴壁后，加入含有不同浓度的葫芦素的培养基，继续培养24、48 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续孵育2 h，检测450 nm处吸光值。

1.2.3 细胞平板克隆形成实验 将HepG2细胞接种于6孔板中，每孔100～200个细胞，每组2个复孔。培养过夜后更换含有不同浓度的葫芦素I的培养基继续培养2周，待形成肉眼可见克隆时终止培养，PBS清洗3次，室温干燥，甲醇固定20 min，弃甲醇后加入吉姆萨工作液染色30 min，流水洗净，干燥后肉眼观察计数细胞克隆数。

1.2.4 流式细胞术检测细胞周期 收集处理好的细 胞， 加 入 800 µL PBS+0.5%BSA洗 涤 1次，离心去上清，加入10 µL破膜剂处理1 min，加入100 µL PI染液，室温下静置20 min，加入400 µL PBS+0.5%BSA重悬细胞，流式细胞仪检测分析细胞周期。

1.2.5 Hochest 33342染色检测细胞凋亡 收集处理好的细胞，加入100 µL 0.01 mg/mL的Hoechst 33342染液，避光染色10 min，PBS洗2次，重悬细胞后滴在干净的载玻片上，并在载玻片一端滴入少许封片剂，取干净的盖玻片从一端缓慢盖下，避免气泡产生，制好后荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.6 Western blot 收集处理后的细胞，提取细胞总蛋白，10%的SDS-PAGE凝胶电泳，250 mA转膜至PVDF膜，5%BSA封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，二抗孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL化学发光显影。

1.2.7 实时定量PCR 收集处理的细胞，TRIzol法提取细胞总RNA，根据试剂盒说明逆转录成cDNA。实时PCR采用SYBR Green染料法，根据说明书体系进行扩增，使用β-actin作为内参基因。QuantStudio™实时PCR软件分析基因相对表达情况。引物序列（5'→3'）STAT3（上游：GGA GAA ACA GGA TGG CCC AA，下游：ATC CAA GGG GCC AGA AAC TG）；Mcl-1（上游：CAC TTC CGC TTC CTT CCA GT， 下 游：GGT GGC CAA AAG TCG CCC）；Survivin（ 上 游：AGG ACC ACC GCA TCT CTA CA， 下 游：TTT CCT TTG CAT GGG GTC GT）；β-actin（上游：CAT GTA CGT TGC TAT CCA GGC，下游：CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT）。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 葫芦素I对肝癌细胞增殖活性的影响

用不同浓度的（0.5、1、5、10 μmol/L）葫芦素I处理肝癌细胞（HepG2、QGY-7703、SMMC-7721）24、48 h，CCK-8法分析葫芦素I对肝癌细胞的细胞活力的影响，结果显示，各浓度的葫芦素I均能抑制肝癌细胞的增殖，并具有时间和浓度依赖性（均P＜0.05）。3种细胞48 h的IC50值分别是0.19、4.16、1.13 μmol/L（图1）。

图1 葫芦素I处理后肝癌细胞增殖活力变化Figure 1 Changes in proliferative viabilities of different types of HCC cells after cucurbitacin I treatment

2.2 葫芦素I对肝癌细胞HepG2克隆形成的影响

细胞平板克隆形成实验分析葫芦素I对肝癌细胞HepG2的克隆形成能力的影响，结果显示，1 μmol/L的葫芦素I处理几乎完全抑制了HepG2细胞的克隆形成（图2）。

图2 葫芦素I处理HepG2后细胞克隆形成情况Figure 2 Colony-forming ability of HepG2 after cucurbitacin I treatment

2.3 葫芦素I对HepG2细胞的细胞周期的影响

流式细胞术检测葫芦素I处理HepG2细胞24 h后细胞周期变化，结果显示，1 μmol/L的葫芦素I引起HepG2细胞周期改变，使细胞周期阻滞在G2期（图3）。

图3 葫芦素I处理后HepG2细胞的细胞周期变化Figure 3 Changes in cell cycle of HepG2 cells after cucurbitacin I treatment

2.4 葫芦素I对HepG2细胞凋亡的影响

葫芦素I处理HepG2细胞24 h后，Hochest 33342染色分析细胞凋亡情况。结果显示，1 μmol/L葫芦素I处理后染色质皱缩、细胞核固缩、核裂解，出现凋亡小体等典型的细胞凋亡形态变化（图4）。

图4 葫芦素I处理后HepG2细胞形态变化（×400）Figure 4 Morphological change of HepG2 cells after cucurbitacin I treatment (×400)

2.5 葫芦素I处理HepG2细胞后蛋白表达变化

用Western blot分析葫芦素I处理HepG2细胞24 h后蛋白表达变化，结果显示，5、10 μmol/L的葫芦素I处理后，抗凋亡蛋白Mcl-1、survivin的表达均明显下调；同时，5、10 μmol/L的葫芦素I处理后，STAT3及其磷酸化分子p-STAT3的表达均明显下调（图5）。

图5 葫芦素I处理后HepG2细胞抗凋亡因子及其相关信号分子蛋白的表达Figure 5 The protein expressions of anti-apoptoti factors and the related signaling molecules in HepG2 cells after cucurbitacin I treatment

2.6 葫芦素I处理HepG2细胞后mRNA表达相对变化

用实时定量PCR分析葫芦素I处理HepG2细胞前后mRNA的相对变化，结果（图6）显示，与对照组比较，1 μmol/L葫芦素I处理组STAT3、Mcl-1、survivin的mRNA表达均明显下调（P=0.000、0.005、0.000）。

图6 葫芦素I处理后HepG2细胞抗凋亡因子及其相关信号分子mRNA的表达Figure 6 The mRNA expressions of anti-apoptoti factors and the related signaling molecules in HepG2 cells after cucurbitacin I treatment

3 讨 论

Mcl-1是Bcl-2家族中的主要抗凋亡蛋白[9]，在肝癌中高表达，与肝癌的生存和耐药相关，抑制Mcl-1可增加肝癌对化疗药物的敏感性[10]。针对Mcl-1开发的抑制剂S63845具有广谱的抗癌效果，且具有较好的安全性[11]。生存蛋白survivin在肝癌中高表达，促进肝癌细胞增殖和生存，降低肝癌细胞对化疗药物的敏感性[12-14]。因此Mcl-1和survivin可能是治疗肝癌的潜在靶点。本研究发现，葫芦素I不仅抑制Mcl-1和survivin的蛋白表达，还下调其mRNA的表达水平，这与在骨肉瘤细胞[5]研究结果一致。

STAT3是与肿瘤相关的一个主要转录因子，在肝癌中持续活化，活化状态的STAT3（p-STAT3 Y705）能进入细胞核调控下游基因表达[15-16]，促进细胞增殖与存活。有大量研究[17-20]表明，抗凋亡Mcl-1和Survivin是STAT3信号通路的下游基因，抑制STAT3通路能显著抑制其下游基因Mcl-1和Survivin的表达。已经发现葫芦素I能抑制Mcl-1和survivin的表达，其是否通过STAT3通路尚不明确，我们的研究结果显示葫芦素I抑制了STAT3的激活，还下调Mcl-1和survivin的mRNA的表达水平，说明葫芦素I是通过STAT3信号通路抑制Mcl-1和survivin的表达。本研究还发现葫芦素I还从转录水平抑制STAT3的表达，与其在塞扎里综合征中的结果一致[21]，STAT3 mRNA表达下调也与microRNA的调控相关[22]。非磷酸化的STAT3也能进入细胞核与染色质结合，维持染色质的稳定，调控基因的表达[23-24]，葫芦素I抑制STAT3的表达还可能破坏染色质的稳定性，造成DNA损伤，其细胞内的具体机制还有待进一步的研究。

肿瘤的发展还与细胞周期密切相关，有研究发现葫芦素I能下调cyclin B1和cdc2的表达[25]，葫芦素D也能引起细胞周期阻滞在G2/M期[26]。本研究发现，葫芦素I能使HepG2细胞周期阻滞在G2期。

本研究发现，葫芦素I能抑制肝癌细胞（HepG2、QGY-7703、SMMC-7721）的增殖，且具有时间和浓度依赖性。葫芦素I抑制HepG2细胞的克隆形成，阻滞周期进展。葫芦素I通过STAT3信号通路抑制Mcl-1和survivin的表达，引起HepG2细胞凋亡。尽管在细胞水平葫芦素I对肝癌细胞凋亡表现出较好效果，但由于生物体的复杂性，在体内是否有同样显著效果还有待进一步研究。

葫芦素I能抑制肝癌细胞增殖，引起细胞周期阻滞，诱导凋亡发生，其初步的分子机制是葫芦素抑制STAT3的激活，从而抑制其下游抗凋亡蛋白Mcl-1、survivin的表达。葫芦素I可能作为一种治疗肝癌的靶向药物。

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