苦参碱对大鼠肝缺血再灌注损伤的抑制作用及机制

白宁，王栋，欧阳锡武，周乐杜，王志明

（中南大学湘雅医院 1. 急诊科 2. 普通外科，湖南 长沙 410008）

在大多数肝脏手术中，如肝移植，规则肝叶切除等，需分次分段阻断肝脏血流控制术中出血，以达到减少出血，同时减少其潜在的副损伤的目的。但该过程可造成肝脏的缺血再灌注损伤，引起肝细胞功能失调[1-2]。大量研究[3-5]表明，肝缺血再灌注损伤常造成肝窦内细胞损伤，从而诱导活性氧自由基富集，释放促炎症反应细胞因子，引起肝细胞坏死，也会引起肝细胞凋亡及自噬，表现出肝功能异常[6]。因此肝缺血再灌注损伤的防治一直是肝脏外科的重要研究领域。已有研究[7]证实中药单体苦参碱（Sophocarpidine，matrine）具有抗炎、抗氧化、保肝等作用，对缺血再灌注损伤引起的炎症反应、细胞凋亡、自噬及抗癌等可能有重要的调节作用[8-9]。另有研究[10-11]发现，苦参碱对肝缺血再灌注损伤引起的炎症反应、肝纤维化及肝细胞异常凋亡具有明显的抑制作用。但苦参碱抑制肝缺血再灌注损伤的机制尚未完全阐明。本研究在建立大鼠肝缺血再灌注损伤模型的基础上，观察苦参碱对肝脏缺血再灌注后的保护作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

健康成年雄性SD大鼠，清洁级，40只，9～12周龄，体质量200～250 g，由中南大学实验动物学部提供。苦参碱（M5319）购于美国Sigma公司。丙氨酸转氨酶（ALT）检测试剂盒、天冬氨酸转氨酶（AST）检测试剂盒、TNF-α ELISA试剂盒和IL-1β ELISA试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供；TUNEL染色试剂盒由美国Promega公司生产；肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）、BAX、激活型caspase-3（cleaved caspase-3，Asp175）及内参β-actin单克隆抗体均为英国Abcam公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 40只SD大鼠随机均分为4组：⑴ 假手术组；⑵ 肝缺血再灌注损伤模型组（模型组）；⑶ 低剂量苦参碱（25 mg/kg）预处理+肝缺血再灌注损伤模型组（低剂量苦参碱组）；⑷ 高剂量苦参碱（50 mg/kg）预处理+肝缺血再灌注损伤模型组（高剂量苦参碱组）。

1.2.2 动物处理 术前12 h禁食，自由饮水，经腹腔注射4%戊巴比妥钠（40 mg /kg）麻醉，固定，常规消毒。取上腹正中切口入腹，低、高剂量苦参碱组大鼠在夹闭门静脉和肝动脉前30 min，经门静脉主干注入各自剂量的苦参碱溶液，假手术组与模型组大鼠则以相同的方式注入等体积的生理盐水；30 min后，模型组与低、高剂量苦参碱组大鼠用无创血管夹阻断肝左、中叶脉管，造成约70%肝脏缺血，60 min后放开血管夹，恢复阻断区血供再灌注120 min，建立肝切除肝缺血再灌注模型[12]，并切除未经缺血处理的肝叶，约占全肝30%。假手术组仅行开腹手术，不行肝切除及肝缺血等处理。

1.2.3 标本处理 再灌注120 min后，采集各组大鼠肝上下腔静脉血，常温1200r/min离心10 min，取血清保存待测；处死各组动物，切取右上叶肝组织，以中性福尔马林溶液固定，常规石蜡切片后用于组织病理学观察，以及肝细胞凋亡检测；另取5 g肝组织破碎离心后用于Western blot检测。

1.2.4 血清学指标检测 大鼠血清ALT、AST含量检测按照ALT、AST试剂盒说明进行，大鼠血清TNF-α、IL-1β的含量分别采用各自ELISA试剂盒检测。

1.2.5 组织病理学检测 HE染色后光镜下观察肝脏组织病理学的改变。

1.2.6 TUNEL法检测肝细胞凋亡 按试剂盒说明进行凋亡检测，DAB显色，苏木素复染。在显微镜下观察、计数、拍照。评判标准：阳性细胞核和细胞碎片呈深浅不一的棕黄色。每张切片随即选取10个高倍视野，计数凋亡细胞。凋亡指数（apoptosis index，AI）=视野内凋亡细胞数/视野内肝细胞数×100%。

1.2.7 Western blot检测 新鲜肝脏组织采用RIPA裂解液冰上完全裂解，12 000r/min，4 ℃离心15 min，取上清收集总蛋白。5×上样缓冲液混合煮沸5 min。垂直板电泳分离条带，转膜，分别加入TRAIL、BAX、cleaved caspase-3单克隆抗体（一抗1:1 000）4 ℃孵育过夜，洗膜后用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（1:5 000）孵育2 h，利用化学发光仪曝光，采集目标蛋白条带。Western blot图像灰度值采用Quantity One 2.4软件分析。

1.3 统计学处理

采用SPSS 18.0软件处理数据，各组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组转氨酶与炎症因子水平

血清学检测结果显示，与对照组比较，其余各组血清ALT、AST、TNF-α、IL-1β水平均明显升高（均P＜0.05），但低、高剂量苦参碱组以上指标的升高程度均低于模型组（均P＜0.05），且高剂量苦参碱组以上指标升高程度均低于低剂量苦参碱组（均P＜0.05）（表1）。

表1 各组转氨酶与炎症因子水平比较（n=10，±s）Table 1 Comparison of the levels of transaminases and in fl ammatory factors among groups (n=10, ±s)

注：1）与假手术组比较，P＜0.05；2）与模型组比较，P＜0.05；3）与低剂量苦参碱组比较，P＜0.05Note: 1) P＜0.05 vs. sham operation group; 2) P＜0.05 vs. model group; 3) P＜0.05 vs. low dose matrine group

组别 ALT（U/L） AST（U/L） TNF-α（ng/L） IL-1β（ng/L）假手术组 49.3±5.7 150.1±11.4 2.11±0.47 1.37±0.25模型组 555.6±46.11) 796.1±57.21) 14.22±1.401) 7.64±0.831)低剂量苦参碱组 267.4±30.81),2) 445.7±37.81),2) 10.37±0.981),2) 4.92±0.941),2)高剂量苦参碱组 197.4±33.51),2),3) 408.9±44.41),2),3) 8.32±1.741),2),3) 2.55±1.111),2),3)

2.2 各组肝缺血再灌注损后肝组织病理学变化

光学显微镜下可见，假手术组肝组织无病理改变，模型组肝细胞肿胀、肝细胞空泡变性和点状坏死，大量炎性细胞浸润；低、高剂量苦参碱组肝组损伤程度及范围均明显小于模型组，表现为组织结构尚清楚，肝细胞轻、中度浊肿，点状嗜酸性变性，轻度肝细胞淤胆，少量炎性细胞浸润，且高剂量苦参碱组肝组织损伤程度轻于低剂量苦参碱组（图1）。

图1 各组肝组织病理学检测（HE×200） A：假手术组；B：模型组；C：低剂量苦参碱组：D：高剂量苦参碱组Figure 1 Histopathological examination in each group (HE×200) A: Sham operation group; B: Model group; C: Low dose matrine group; D: High dose matrine group

2.3 各组缺血再灌注后的肝细胞凋亡情况

TUNEL染色结果观察显示，假手术组仅有少量的凋亡阳性细胞，模型组可见大量胞核黄染的阳性细胞，2个剂量苦参碱组阳性细胞明显少于模型组，高剂量苦参碱组阳性细胞减少数量更为明显；比较各组的AI，差异均有统计学意义（均P＜0.05）（图2-3）。

图2 各组TUNEL染色结果（×200） A：假手术组；B：模型组；C：低剂量苦参碱组：D：高剂量苦参碱组Figure 2 TUNEL staining results in each group (×200) A: Sham operation group; B: Model group; C: Low dose matrine group; D: High dose matrine group

图3 各组AI比较 注：1）与假手术组比较，P＜0.05；2）与模型组比较，P＜0.05；3）与低剂量苦参碱组比较，P＜0.05Figure 3 Comparison of AI among groups Note: 1) P＜0.05 vs.sham operation group; 2) P＜0.05 vs. model group;3) P＜0.05 vs. low dose matrine group

2.4 Western blot检测结果

Western blot结果显示，各组肝组织TRAIL、BAX、cleaved caspase-3蛋白的表达水平均明显高于假手术组（均P＜0.05），其中模型组以上蛋白的上调最为明显，2个剂量苦参碱组以上蛋白上调程度均明显低于模型组，且高剂量苦参碱组上调程度低于低剂量苦参碱组（均P＜0.05）（图4-5）。

图4 各组Western blot检测结果Figure 4 Western blot results of each group

图5 各组各蛋白相对表达量比较 注：1）与假手术组比较，P＜0.05；2）与模型组比较，P＜0.05；3）与低剂量苦参碱组比较，P＜0.05Figure 5 Comparison of the relative protein expression levels among groups Note: 1) P＜0.05 vs. sham operation group; 2) P＜0.05 vs. model group; 3) P＜0.05 vs. low dose matrine group

3 讨 论

中药单体苦参碱具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、免疫抑制和保肝等作用[7]。已用于临床治疗，主要用于治疗慢性乙型病毒性肝炎[8]，对多种原因引起的肝损伤及肝纤维化均有较好的治疗作用[8-9]。本研究通过大鼠肝缺血再灌注损伤模型，观察苦参碱的干预作用，结果发现，苦参碱对大鼠肝缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，表现为血清转氨酶水平、炎症介质水平较模型组明显降低，肝组织病理损伤明显减轻，且呈明显的剂量依懒性。

为进一步探讨苦参碱抑制肝缺血再灌注损伤的机制，本研究检测了各组再灌注后肝细胞的凋亡情况，结果显示，苦参碱能明显减少缺血再灌注后肝组织的肝细胞凋亡。细胞凋亡是动物界及人类重要的细胞死亡模式，受多种因素的调控。TRAIL是近年来发现的新的TNF家族成员[13]，TRAIL参与T细胞、NK细胞对集体的免疫监视，阻止肿瘤细胞转移，因此在肿瘤治疗方面备受关注。另外发现，TRAIL通过结合靶细胞相应的受体，发挥凋亡诱导作用。诸多研究证实，TRAIL对多种实体肿瘤细胞存在杀伤作用，如NF-κB可诱导TRAIL信号调节肝癌细胞凋亡[14]，肿瘤免疫耐受过程中，TRAIL起重要的调节作用，许多海洋药类可通过TRAIL途径调节细胞凋亡[15]。近年越来越多的证据显示，在正常人细胞中，TRAIL具有调节细胞凋亡的作用。梁艳等[16]研究发现，TRAIL可诱导正常人肝细胞线粒体损伤，促进肝细胞凋亡，而且人角质细胞凋亡可通过TRAIL途径[17]。本研究结果显示，大鼠肝缺血再灌注后肝组织TRAIL蛋白表达明显升高，表明TRAIL途径在大鼠缺血再灌注引起的肝细胞凋亡过程中起重要作用。

TRAIL途径可通过诱导促凋亡蛋白BAX的表达，而BAX的激活可抑制肝细胞线粒体转膜能力，进而释放细胞色素C，促进凋亡关键因子caspase-3[18]，最终引起细胞凋亡[17,19-21]。本研究证实，大鼠肝缺血再灌注后BAX蛋白以及激活型caspase-3的表达均明显上调，可见，在大鼠肝缺血再灌注损伤中，TRAIL-BAX-caspase-3途径的活化是肝细胞凋亡的重要原因。苦参碱预处理同样明显降低了缺血再灌注后肝组织BAX蛋白的表达以及激活型caspase-3水平。由此可有推测，苦参碱可能是通过抑制缺血再灌注后TRAIL的表达，进而减少了BAX与caspase-3的活化，减轻大鼠肝缺血再灌注后肝细胞的凋亡，从而有效抑制肝缺血再灌注损伤。

总之，苦参碱对大鼠肝缺血再灌注损伤有明显的抑制作用，本研究初步探讨了其作用机制，认为其抑制TRAIL-BAX-caspase-3途径引起的肝细胞凋亡可能是重要的作用机制之一。因而，进一步阐明其作用机制，并将其进一步开发利用，将有望对临床肝缺血再灌注损伤的防治提供有效手段。

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