单增李斯特菌食品分离株LM201的双组分信号转导系统的生物信息学分析

张 娜， 欧 娅， 郑金水， 刘 梅,,3*

(1.华中农业大学动物医学院 兽医微生物学与免疫学实验室，湖北 武汉 430070； 2.华中农业大学 农业微生物学国家重点实验室，湖北 武汉 430070; 3.华中农业大学 预防兽医学湖北省重点实验室，湖北 武汉 430070)

单增李斯特菌(Listeriamonocytogenges,Lm)是导致人兽共患病—李斯特菌病(listeriosis)的食源性病原菌。Lm的易感者为免疫缺陷和免疫力低下者，其侵入人和动物机体导致胃肠炎、脑膜炎、脑炎、败血症、流产和死胎等病症。李斯特菌病虽发病率不高，但病死亡率可达20%～30%[1]。近几年，我国不断有人和动物感染李斯特菌病的报道[2]，而且报告病例涉及我国大部分省市，严重威胁着人们的健康和畜牧业发展。因此，对Lm毒力调控方面的研究工作不容忽视。Lm于外界环境中时是腐生菌，侵入宿主机体内则变为致病菌，其转变机制主要是Lm中有一个转录调控因子—PrfA，它像一个开关，当Lm处于外界环境时，PrfA处于低活性状态，受其调控的相关毒力基因表达水平低；当Lm侵入宿主细胞后，PrfA被激活，进而诱导InlA、InlB、LLO、PlcA、PlcB、Hpt和ActA等毒力因子基因的表达，使得Lm能在宿主细胞中繁殖及在细胞间传播[3]。转录调控因子活性的激活，需要细菌首先感应环境变化，然后将信号传递至菌体内，从而做出相应的调控反应，这个过程涉及到细菌的信号转导系统，其中双组分信号转导系统(Two-component signal transduction systems，TCSs)在细菌的信号传导过程中起至关重要的作用[4]。TCSs参与调控细菌的生长代谢、生物被膜形成以及病原菌的毒力等。因此，研究Lm的TCSs是探究Lm致病机制的重要方面[5]。TCSs通过调控蛋白质磷酸化来实现信号转导。典型的TCS由组氨酸蛋白激酶(Histidine kinase，HK)和应答调节蛋白(Response regulator，RR)组成，HK和RR通常是由基因组上同一个操纵子的两个邻近基因编码。其经典调控机制为HK感受胞外信号并自体磷酸化、HK将磷酸基团转移给RR使之活化、活化的RR结合到靶序列从而调控相关基因的转录表达。研究发现，细菌TCSs中的HK除能激活同源RR外，还能激活非同源RR，或两个不同的HK可以激活同一RR，即形成one-to-many 或 many-to-one的交叉调控模式，这有利于菌体更快更好地适应外界环境[6]。Lm的TCSs的交叉调控模式是怎样的呢？目前关于Lm的TCSs研究主要针对单对TCS、单个HK或RR的研究，关于Lm的TCSs交叉调控方面的系统化研究则鲜有报道。研究TCSs的交叉调控网络，首先需要全面统计分析和了解目标菌株所含有的TCSs的数量、结构和功能。本研究以本实验室已完成全基因组测序的Lm食品分离株LM201[7]为研究对象，应用生物信息学方法，对LM201的TCSs进行了数量统计、结构分析和功能预测，从而为进行Lm的TCSs交叉调控网络的研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

基因组序列：Lm菌株LM201是从冷冻肉中分离得到，经本课题组测定，其血清型为4b，有中等生物被膜形成能力，小鼠LD50为6.3×106CFU。本课题组已完成LM201全基因组测序工作，其序列(AYPT00000000)[7]已提交至NCBI。L.innocuaClip11262 (NC_003212.1)、L.ivanoviisubsp.ivanoviiPAM 55(FR687253.1)、Bacillussubtilis168 (NZ_CP010052.1)和L.monocytogenesEGD-e (AL591824.1)的全基因组序列均来自GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome)。

1.2 方法

1.2.1 双组分信号转导系统的预测 利用Pfam数据库(http://pfam.xfam.org/)中HKs的保守结构域HATPase_c(Pfam02518)搜寻LM201的HKs，用RRs的保守结构域 Response_reg (Pfam00072)搜寻RRs，通过NCBI的BLAST确认搜到的HKs和RRs。HATPase_c是HK的催化结构域，是ATP结合的激酶功能区，位于 HK 的 C-末端；Response_reg是RR的磷酸受体结构域，位于 RR 的 N-末端，属于REC超家族的成员。

1.2.2 结构与功能分析 功能域分析利用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)来完成。蛋白质跨膜螺旋结构域用TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services /TMHMM-2.0/)进行预测。利用ClustalW软件进行多重序列比对。采用BLASTP (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)进行同源性比对。

2 结果与分析

2.1 LM201的TCSs统计及序列比对分析

利用Pfam数据库对LM201基因组的TCSs进行了搜寻和统计。从数量上讲， LM201有14对HK/RR和2个孤儿RR，与同种同血清型的L.monocytogenesF2365 (4b型)数量一致；比同种不同血清型的L.monocytogenesEGD-e (1/2a型)少一对双组分(lmo1061/lmo1060)；与同属不同种的L.ivanovii和L.innocua的TCSs数量相近；与同目不同属的Bacillussubtilis数量则相距甚远(表1)。

通过序列比对分析发现，LM201的TCSs与同种同血清型菌株F2365的TCSs的组成和结构一致；与同种不同血清型菌株EGD-e的TCSs有一一对应关系(结果图略)。

表1 LM201基因组中TCS数目的预测结果

注：*作为对照

2.2 HK的结构域组成

利用SMART对预测的14个HKs进行了结构域的分析(表2)。LM201的HKs具有11种不同组成结构，所有HK的C端均具有典型结构域HATPase_c (激酶催化结构域)；N端具有不同结构域，包括HAMP、PAS、PAC和GAF等。HAMP主要存在于热休克蛋白HSP90、甲基转移酶等与ATP结合的蛋白质中，其主要功能可能是感应与细菌细胞渗透相关的信号[8]；PAS (Per-Arnt-SIM)含有与血红素蛋白和光敏黄蛋白结合的固定区域，可感应氧化还原电位、光及氧等信号，参与调控细菌氧化还原反应[9]；PAC 可以修饰PAS，可能有助于PAS的折叠[10]；GAF存在于光合细菌及非光合细菌中，主要通过与核苷酸及其他小分子配体结合，改变配体构象而发挥催化调节活性功能[11]。

HK02 (RS05925)的N端为HPT结构域，中部有H-Kinase dim区域，C端是CheW受体结构域。HPT (Histidine phosphotransfer)只存在于真细菌中，其所含有的组氨酸残基参与磷酸基团的转移反应，介导HK和RR的信号传递[12]；H-Kinase dim是含有该结构域的组氨酸激酶CheA形成二聚体的区域[13]；CheW受体结构域存在于参与细菌趋化性调控的TCS中，含有该结构域的组氨酸激酶CheA可以和连接蛋白CheW偶联，CheW参与细菌的趋化性信号传导[14]。

表2 LM201的HKs的编号、基因组上的位置和结构域组成

续表2

本研究通过TMHMM Server v.2.0对LM201中的HKs进行了跨膜结构分析(结果图略)。除HK11(RS11285)外，其余HKs的分析结果与表2第三栏所示的跨膜螺旋区(Transmembrane helix region，蓝色矩形所示)结构一致。TMHMM Server v.2.0分析结果显示，HK11有两个跨膜螺旋区，但用SMART预测时，只显示了一个跨膜螺旋区(表2)，原因是另一个跨膜区与低复杂性结构域(Low compositional complexity，粉红色矩形所示)重叠了。

2.3 RR的结构域组成与分类

RR的结构域组成与分类利用SMART，本研究对预测的16个RRs的组成结构和亚家族的归属进行了分析(表3)。LM201的 RRs的N端都含有基本结构-磷酸受体结构域REC(RR15 (RS05910)的REC在C端)，此结构域中含有保守的Asp (天冬氨酸残基)磷酸化位点，即RR的磷酸化位点；RRs的C端为输出区域，具有多样性，但多数RR的输出区域为典型结构Trans reg_C。通过分析RRs的输出区域，发现LM201的16个RRs分属于OmpR、CheV、CheY、NarL、LytTR、YesN和AmiR_NasR这7个亚家族(表3)。

表3 LM201的RRs的编号、基因组上的位置、结构域组成和亚家族分类

续表3

其中RR01 (RS03875)、RR03 (RS01445)、RR04 (RS01850)、RR05 (RS02250)、RR06 (RS13770)、RR09 (RS09240)、RR10 (RS09890)、RR11 (RS11290)和RR13 (RS10265)这9个RRs的输出区域为Trans reg_C，具有典型的翼状螺旋-转角-螺旋 (HTH) 结构，属OmpR亚家族，占LM201总RRs的56%。OmpR亚家族是目前已知数目最多的一类应答调节蛋白[15]。RR08 (RS07570)和RR16 (RS01920)输出区域为HTH-LuxR，属NarL亚家族，是DNA结合区域，通常发挥转录激活作用[16]。RR07 (RS14980)输出区域为LytTR，是一种新型的保守DNA结合域，属于AlgR/AgrA/LytR转录调控亚家族，此类结构域在GC含量较少的革兰阴性菌中常见，参与细胞的自溶调控[17]。RR12 (RS08195)输出区域为ANTAR，属AmiR_NasR亚家族，目前发现只在细菌中有ANTAR，其是RNA结合域，通过接受磷酸基团发挥转录抗终止作用[18]。RR14 (RS11565)输出区域为HTH-ARAC，属YesN亚家族，HTH为螺旋-转角-螺旋结构，是大多数细菌转录调控蛋白结合DNA的模体，AraC是阿拉伯糖操纵子编码的转录调节蛋白，是含有HTH结构比较多的一类转录调控蛋白，其包含的两个HTH结构形成凹槽以结合同源的DNA[19]。RR15 (RS05910)输出区域为CheW，位于N端，能与CheA发生偶联，属于CheV亚家族，主要影响趋化性调控的稳定性[20]。

由表3可知，LM201中除RR02 (RS05920，属CheY亚家族)无输出区域外，其他的RRs都有C端输出区域。C端输出区域通常与靶DNA或靶蛋白结合，发挥转录因子功能。当RR缺乏输出区域时，其通过其他方式发挥作用，例如，在大肠埃希菌中，与LM201的 RR02同类的RR蛋白CheY被磷酸化后，虽然CheY没有C端输出区域，但其直接结合到被调控蛋白—鞭毛运动调控蛋白FliM或者FliN上，使后者构象发生改变，从而改变细菌鞭毛的运动方向[21]。

2.4 功能预测

功能预测主要根据氨基酸序列一致性(identity)和蛋白质保守结构域进行预测。以上HK和RR的结构分析结果为进行TCS的功能预测打下了基础。利用BLASTP和参考相关文献对搜寻到的TCSs进行了功能预测，结果见表4。比对结果选取一致性最高且功能验证过的TCSs的功能作为参考。

LM201中有14对HK/RR和2个孤儿RR。其中，RS03880/RS03875、RS02245/RS02250和RS09895/RS09890编码的3对TCSs以及RS05910编码的孤儿RR的预测功能在Lm中未见报道，但在其他菌中有报道(表4**)；RS11570/RS11565编码的TCS的功能为未知，在Lm和其他菌中均未见报道(表4***)；剩余的10对TCSs和一个孤儿RR (RS01920)的预测功能在Lm中已报道(表4*)。

Lm中已报道的TCSs的功能主要涉及毒力(VirSR，DegU)、抗生素抗性(CesKR，AgrAC)、细胞壁渗透压(KdpDE，LiaSR)、氧化还原(ResDE)、趋化性(CheAY)和磷酸酶合成(PhoPR)等。

YycGF、HssSR、YclKJ和CheV的功能在Lm中未见报道，但在其他菌中已有报道，如：YycGF在枯草芽胞杆菌中调控细胞壁的合成[22]；HssSR在金黄色葡萄球菌中调控胞内血红素平衡和毒力，将该双组分的RR缺失后，金黄色葡萄球菌对抗菌肽—菌丝霉素的抗性增强，而Lm的亲本野生株与其HssSR的RR缺失突变株对该抗菌肽均不敏感[23]，可见，同类TCS在不同细菌中可能有不同的调控作用；YclKJ在枯草芽胞杆菌中调控厌氧生长[24]；CheV在枯草芽胞杆菌中调控趋化性[25]，与在Lm中已报道的CheAY位于同一个操纵子上，因此，推测CheV在Lm中也可能参与趋化性调控。YycGF、HssSR、YclKJ和CheV在Lm中的功能有待研究。

表4显示，RS11570/RS11565编码的双组分的预测功能为未知，在Lm和其他菌中均未见报道。我们发现，RS11570编码的HK在C端229～1734处存在一个YesM保守结构域，RS11565基因编码的RR含有一个YesN保守结构域，对该双组分进行一致性分析发现，其与枯草芽胞杆菌的YesM/YesN的一致性最高，分别为27%和40%，但其功能在枯草芽胞杆菌中未见报道。所以RS11570/RS11565编码的双组分在Lm中的功能有待探索。

表4 LM201的TCS一致性比较和功能预测

注：Bs：枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)；Lm：单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)；Sa：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)；*：Lm中功能已被报道的双组分；**：Lm中功能未见报道的双组分，但该双组分功能在其他菌中有报道；***：功能未知的双组分

3 讨 论

细菌耐药性问题一直困扰着人们。细菌有TCSs，哺乳动物没有TCSs，故以TCSs为靶标研发新型抗菌药物是解决细菌耐药问题的有效办法之一。探索Lm的TCSs的交叉调控模式能为该应用前景提供理论依据。本研究通过生物信息学方法探明了Lm菌株LM201中TCSs的数量、结构、分类和预测功能，该结果为构建Lm的TCSs的交叉调控网络提供参考。

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