施氮量对烤烟氮代谢关键酶基因表达及代谢产物的影响

鲁黎明，曾孝敏，顾会战，张启莉，喻 晓，王 栋，何佶弦，李立芹，*

(1.四川农业大学 农学院，四川 成都 611130； 2.四川省烟草公司 广元市公司，四川 广元 628017)

碳氮代谢是烟草的基础代谢，不仅影响烟草的正常生长发育，而且影响与烟草品质相关的各类化合物的合成与转化，进而影响烟叶产量和品质形成[1]。其中，氮代谢包括无机氮(硝态氮)的还原、同化，以及有机含氮化合物的转化、合成等过程。烟叶中氮代谢强度与施氮量水平关系密切。岳红宾[2]与许晨曦等[3]的研究结果均显示，随着氮素水平提高，叶片中硝酸还原酶(NR)的活性有上升趋势，供氮较低时，烟叶由氮代谢向碳代谢转化的时间提前，反之则推后。李洪臣等[4]的研究表明，增加施氮量与追氮比例，可以增强烟株的氮代谢强度，改善其光合性能。在烟草氮代谢关键基因响应外界氮素诱导研究方面，王红丽等[5]研究发现，NR基因的表达量在不同供氮水平间并无明显差异，而谷氨酰胺合成酶(GS)基因的表达量，在烟叶进入成熟期前随施氮量的增加而增强，在成熟期后则表现相反。刘维智[6]研究了缺氮处理对亚硝酸还原酶及硝酸盐转运体(NRT)基因表达的影响，缺氮可以显著诱导这2个基因的表达，暗示其在烟草氮代谢中发挥着重要作用。烤烟氮代谢产物含量与氮素供应量呈显著的正相关关系[6]。研究表明，在一定范围内，随着施氮量增加，烤烟中的总氮、烟碱、蛋白质和氨基酸含量均有不同程度的增加[6，7-10]。在烤烟生长发育过程中，烟叶总氮的相对含量不断降低，但当供氮量增加时，下降幅度明显减慢，烟碱含量显著增加[11]。

目前，有关氮素供应水平对烟草氮代谢关键酶活性影响的研究较多，但是，对关键酶基因表达影响的研究较少，而且还缺乏施氮水平、基因表达及氮代谢产物的相关关系研究。本研究通过田间试验，分析不同施氮量对烤烟氮代谢关键基因表达及含氮化合物含量的影响，以期为烟草氮代谢的理论研究及其调控提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参试烤烟品种为云烟87和K326。供试肥料包括烟草专用复合肥(N-P2O5-K2O，10%-15%-25%，四川金叶化肥有限公司)、磷酸一铵(N-P2O5-K2O，10%-44%-0，四川龙蟒集团)、硫酸钾(K2O 50%，四川川化青上化工有限公司)。

1.2 试验设计

试验于2016年在四川省广元市剑阁县普安镇剑坪村广元市烟草公司科研基地进行。采用二因素裂区设计，以氮肥施用量为主区因素(A)，品种为副区因素(B)，共6个处理，每处理重复3次。氮肥施用量：90 kg·hm-2(A1)、105 kg·hm-2(A2)、120 kg·hm-2(A3)；品种：云烟87(B1)和K326(B2)。每小区栽烟60株，行距1.1 m，株距0.5 m。试验地磷、钾肥施用量分别为P2O5157.5 kg·hm-2、K2O 210 kg·hm-2。

1.3 试验方法

2016年1月按常规漂浮育苗法育苗，5月1日移栽。肥料分基肥、追肥施用(基追比7∶3)，5月16日及5月30日各追肥一次。田间管理按照当地优质烟叶管理规程进行。分别于移栽后45、60、80 d分小区采集鲜烟叶样品。

鲜烟叶的采集。每个试验小区选择30株长势基本一致的烟株挂牌，每次采摘中部叶(第10叶位)。将采摘的中部叶迅速沿主脉分开：一半鲜样立即用液氮冷冻，保存于-80 ℃冰箱，用于相关基因表达量检测；另一半鲜样先在105 ℃杀青，再粉碎保存，用于测定烟叶中的烟碱、总氮及可溶性蛋白质含量。

烟碱及总氮含量的测定，参照王瑞新[12]的方法进行。可溶性蛋白质含量的测定，采用考马斯亮蓝G-250染色法[13]。

1.4 基因表达量分析

采用Trizol法[14]提取样品总RNA。按照Fermentas公司RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis试剂盒的操作说明合成cDNA第一条链。

参考GenBank数据库中NR、GS、谷氨酸合成酶(GOGAT)的基因cds序列设计引物(表1)。以反转录合成的cDNA为模板，加入相应引物及其他反应试剂，进行定量PCR扩增。反应体系(10 μL)：2×Premix SYBR Max 5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 2 μL。反应条件：50 ℃孵育2 min，95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 sec，60 ℃ 1 min，40个循环。

1.5 数据分析

试验所得数据采用Excel 2010和SPSS 20.0软件进行统计分析与作图。

2 结果与分析

2.1 基因相对表达量

2.1.1 NR

NR是植物氮代谢途径的第一个关键酶，也是氮代谢强弱的关键衡量指标[15]。在本研究中，NR基因表达量在45～80 d间总体表现为先降低后升高，并在栽后80 d达到最高(图1)。由此可见，在本研究施氮量水平下，NR的转录在烟株生长后期仍然维持在一个较高的水平，以利于氮素同化。在成熟期(80 d)，同一施氮水平上不同品种间NR的表达水平存在显著(P<0.05)差异，说明其氮素响应机制并不相同。

表1qRT-PCR所用引物序列

Table1Primers for qRT-PCR

引物Primer序列Sequences(5′→3′)EF⁃1a(tobacco)⁃FTGAGATGCACCACGAAGCTCEF⁃1a(tobacco)⁃RCCAACATTGTCACCAGGAAGTGNR⁃FTCAGAAGCCATTTTGAGAGAACATNR⁃RAATCATAGGAGGTGGTCCACAAGGS⁃FCACGAAACAGCCAACATCAGGS⁃RCCGTCCTTCTGTCCTCAAAAGOGAT⁃FGCTCCGGTGGGTCAAATGGOGAT⁃RCTTTCGTGCTGCCCGTTT

2.1.2 GS

GS催化谷氨酰胺的合成，是高等植物铵离子同化的主要途径[16]。本研究中，各处理GS基因的相对表达量总体呈现出随生育进程而上升的趋势，且前期上升较快，后期上升较慢(图2)，说明烟株后期铵离子同化仍然维持在较高水平。

2.1.3 GOGAT

2.2 含氮化合物含量

2.2.1 烟碱

烟碱是烟草所特有的生物碱，也是一类含氮的次生代谢产物[17]。总体而言，各处理的烟碱含量随着生育进程呈现出上升的趋势。如表2所示：栽后45、60 d，各处理烟碱含量差异不显著；但在移栽后80 d，低氮(A1)水平下两品种烟叶的烟碱含量表现出显著差异(P<0.05)。

相同移栽天数不同处理上无相同小写字母的表示差异显著(P<0.05)。下同。Treatments marked without the same letters indicated significant difference at P<0.05 during the same growth period. The same as below.图1 各处理不同时期硝酸还原酶的基因相对表达量Fig.1 Comparison of relative expression levels of nitrate reductase (NR) gene among different treatments at different stages

图2 各处理不同时期谷氨酰胺合成酶基因的相对表达量Fig.2 Comparison of relative expression levels of glutamine synthetase (GS) gene among different treatments at different stages

图3 各处理不同时期谷氨酸合成酶基因的相对表达量Fig.3 Comparison of relative expression levels of glutamate synthase (GOGAT) gene among different treatments at different stages

表2各处理不同时期烟叶烟碱含量

Table2Nicotine content in tobacco leaf under different treatments at different stages %

同列数据后无相同小写字母的表示差异显著(P<0.05)。下同。

Data marked without the same letters in the same column indicated significant difference atP<0.05. The same as below.

2.2.2 总氮

总氮是烟叶内含氮化合物的总和，与外界环境中的氮素供应密切相关。从表3可以看出，在相同生育期，各处理总氮含量无显著差异。随着烟草生育期进程，各处理烟叶的总氮含量表现出下降趋势。这一方面是因为烟叶成熟期碳代谢较强；另一方面，成熟期也是烟叶衰老的过程，含氮化合物的降解较多，导致总氮含量降低。

2.2.3 可溶性蛋白

植物体内的可溶性蛋白质，大多是参与各种代谢的酶类，其含量是衡量植物体总代谢强度的一项重要生理生化指标[18]。在烟草整个生育期中，可溶性蛋白的含量呈现出先升高后降低的趋势(表4)，以栽后60 d含量最高，说明打顶期是烟株各类代谢活动最旺盛的阶段。栽后45 d，低氮(A1)水平烟株可溶性蛋白含量显著(P<0.05)低于其他供氮水平。栽后80 d，云烟87(B1)的可溶性蛋白含量随供氮水平增加而显著(P<0.05)上升，而K326(B2)的可溶性蛋白含量在各供氮水平下无显著差异。

表3各处理不同时期烟叶总氮含量

Table3Content of total nitrogen in tobacco leaf under different treatments at different stages %

2.3 氮代谢关键酶基因表达量与含氮化合物含量的相关分析

表4各处理不同时期烟叶可溶性蛋白含量

Table4Content of soluble protein in tobacco leaf under different treatments at different stages %

由表5可见，栽后45 d，NR基因的表达量与烟碱含量呈显著(P<0.05)负相关，与可溶性蛋白含量呈极显著(P<0.01)正相关。栽后60 d，GS基因的表达量与烟碱含量呈显著(P<0.05)负相关。栽后80 d，3个氮代谢关键酶基因的表达量与3个含氮化合物之间无显著相关性。

表5各时期氮代谢关键酶基因表达量与含氮化合物含量的相关性

Table5Correlation between gene expression in nitrogen metabolism and nitrogenous compounds at different stages

栽后天数Daysafterplanting/d基因Gene含氮化合物Nitrogenouscompounds烟碱Nicotine总氮Totalnitrogen可溶性蛋白Solubleprotein45GOGAT030402640028GS-0567-00920216NR-0835∗06970964∗∗60GOGAT-04730440016GS-0901∗0388045NR0058-0162-032380GOGAT-015-02240211GS027-03540541NR0689-07530716

*与**分别表示显著(P<0.05)与极显著(P<0.01)相关。

* and ** represented significant correlation atP<0.05 andP<0.01， respectively.

3 讨论

氮素对农作物的生长发育与产量形成至关重要[19-20]。对烟草而言，氮素不仅影响到碳氮代谢的水平与糖、氮、烟碱等物质的积累，也会影响碳氮代谢转化的时间与速度[17]。在烟叶生产中，氮素通过影响烟草的碳氮代谢来影响其产量和品质，氮素过多或过少时，均会导致烟叶产量下降，化学成分不协调，品质变差[21-22]。

NR是氮代谢途径的关键酶与限速酶，也是烟草氮同化的最初反应催化者[5]。连文力[23]研究表明，在烟叶成熟期，NR基因表达维持在较高水平，并且施氮量低的处理的NR基因表达量显著高于施氮量高的处理。本研究也显示，在烟叶成熟期，NR基因的表达量维持在高水平，而且中等施氮水平下NR基因表达量要高于其他供氮水平。NR在烟叶生长后期仍维持在较高水平，表明烟株进入成熟期后仍然具有较高的氮同化能力，以维持烟株的基础氮代谢。

氮代谢途径中关键酶基因的表达水平与烟叶中含氮化合物的含量密切相关。相关性分析结果显示，在烟叶大田生长前期，NR基因的表达量与烟叶中可溶性蛋白含量呈现极显著正相关，说明此时烟叶氮同化的产物大多为参与基础代谢的酶类，烟叶进行着旺盛的生长。而前、中期烟碱的含量则与烟叶NR、GS的表达量呈现显著负相关关系。烟叶的氮代谢是一个非常复杂的生化过程，受多种因素的影响。深入分析其中的分子机制，对于调控烟叶中烟碱的含量、提高烟叶的品质，具有十分重要的意义。

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