山奈酚抑制小鼠黑色素瘤细胞增殖的缝隙连接机制观察

周瑶，唐毅，杜标炎

(1湖南中医药高等专科学校，湖南株洲412012；2湖南中医药高等专科学校附属第一医院；3广州中医药大学)

黑色素瘤对放疗、化疗不敏感，且容易转移复发，患者预后差[1,2]。山奈酚属于黄酮类化合物，具有抗肿瘤作用，且毒副作用小，能提高正常皮肤的抗氧化能力，抑制皮肤损伤和肿瘤发生[3～5]。缝隙连接又称信息连接，是相邻细胞侧面的一种跨膜通道，主要介导细胞间的物质和信息交换，对细胞新陈代谢、内环境稳定、增殖和分化等生理过程均具有重要的调节作用。研究表明，多种抗肿瘤药物的活性成分可通过加强肿瘤细胞的缝隙连接通讯功能达到抗肿瘤的效应。缝隙连接的基本单位为缝隙连接蛋白(Cx)，其在肿瘤细胞的形成和发展方面具有重要的调节作用[6,7]，其中以缝隙连接蛋白43(Cx43)在人体内分布最广、数量最多、与肿瘤联系最为密切[8,9]。2016年1月～2017年3月我们从调节细胞间Cx43表达量和缝隙连接通讯的角度入手，观察了山奈酚抑制小鼠黑色素瘤B16细胞增殖的作用。现报告如下。

1　材料与方法

1.1材料山奈酚购自美国Sigma公司(批号：60010，纯度>97%)。小鼠黑色素瘤细胞B16购于中国科学院细胞库。细胞培养用RPMI 1640粉、胰蛋白酶和新生牛血清、Cx43一抗均购自Gibco公司，青、链霉素双抗合剂购自Hyclone公司，MTT购自美国Sigma公司，二甲基亚砜(DMSO)购自上海沪试实验室器材股份有限公司。倒置显微镜(重庆COIC)，Bio-Rad-680型全自动酶标仪(日本Bio-Rad)。

1.2细胞培养将B16细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养；第2天，弃掉原培养基，替换为含10% FBS+90% RPMI 1640+1%双抗的完全培养基，继续培养；当细胞融合率达80%～90%时，1∶2胰酶消化传代。

1.3山奈酚抑制B16细胞存活率的最佳浓度筛选将B16细胞接种于96孔板(2×104个/mL，每孔100 μL)培养24 h，分别加入终浓度为3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L山奈酚，每组设6个复孔(100 μL/孔)。培养箱中继续培养72 h，采用MTT法检测细胞存活率。酶标仪测定490 nm波长处每孔吸光度(A)值。计算山奈酚对B16细胞的半数致死量。结果显示，3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L山奈酚处理细胞72 h，细胞增殖抑制率分别为5.325%、12.148%、16.974%、34.345%、61.764%、77.716%，即不同剂量的山奈酚对B16细胞均有生长抑制作用，其作用呈浓度依赖性。山奈酚对B16的半数致死浓度为34.38 μmol/L，因此后续实验中山奈酚的药物浓度选择为12.5、25、50 μmol/L。

1.4山奈酚对B16细胞数量及形态影响的观察将细胞消化后接种于24孔板培养24 h，随机分为四组，分别加入0(阴性对照)、12.5、25、50 μmol/L山奈酚，作用72 h，光镜下观察各组细胞的数量及形态变化。

1.5山奈酚对B16细胞缝隙连接通讯功能影响的观察将细胞预先分为供体细胞组和接受细胞组，两组分别设山奈酚0、12.5、25、50 μmol/L四个浓度，均药物干预72 h；将各浓度组供体细胞用PBS洗1次，避光下将细胞与Calcein-Am 0.2 μL和CMTMR-Am 0.4 μL用无血清RPMI 1640培养基共同孵育，1 h后消化计数，稀释至5 000个/mL；另将各浓度接受细胞用PBS洗1次，按原浓度对应组分别重新添加对应浓度药液，仍为0、12.5、25、50 μmol/L四个浓度；将稀释好的供体细胞添加至对应浓度的接受细胞组，每孔添加1 mL供体细胞悬浮液，孵育4 h；采用荧光示踪法于荧光显微镜下计算每个供体细胞周围含有Calcein-Am的接受细胞数目。

1.6山奈酚对B16细胞Cx43蛋白表达影响的观察将细胞消化后接种于24孔板培养24 h，随机分为四组，分别给予0、12.5、25、50 μmol/L山奈酚干预72 h，收集各组细胞，采用Western blotting法检测Cx43蛋白相对表达量。

2　结果

2.1各组细胞生长形态比较光镜下可见阴性对照细胞密度高，形态多为菱形，细胞轮廓清晰，细胞核染色均匀。山奈酚组随着山奈酚浓度的升高，镜下细胞数量越来越少，细胞形态逐渐不规则，出现很多分支突起；上述变化以50 μmol/L组表现最为明显，且细胞核中出现明显颗粒状物质。

2.2各组细胞缝隙连接通讯功能比较山奈酚作用于B16细胞72 h时，在荧光显微镜下可见供体细胞贴壁不久即呈圆形，随着山奈酚浓度的增加，每个黄色供体细胞旁的绿色接受细胞数目明显增多。0、12.5、25、50 μmol/L山奈酚组每个供体细胞周围接受细胞的个数分别为(1.95±1.35)、(7.10±2.12)、(13.48±5.36)、(35.13±6.09)个，各浓度间比较P均<0.01。

2.3各组Cx43蛋白表达比较0、12.5、25、50 μmol/L山奈酚组Cx43蛋白相对表达量分别为0.17、0.28、0.48、0.83，各浓度间比较P均<0.01。

3　讨论

山奈酚是一种研究较多的具有抗癌效应的黄酮类化合物，主要来源于姜科植物山奈的根茎，在其他植物如蔬菜、水果、中药材中也广泛存在。已有大量研究报道，山奈酚对肝癌、胃癌、肠癌、肺癌、乳腺癌、胆管癌、大鼠前列腺细胞癌、白血病等具有抗癌效应，且安全无毒，具有良好的临床应用前景[4，9，11～16]。

缝隙连接是细胞间一种重要的细胞连接，能联通相邻两侧细胞，是细胞间重要的交通管道，供细胞间交换小分子物质和离子等，以传递细胞间的化学信息，故又被称为通信连接[17]。研究表明，缝隙连接通讯功能低下是肿瘤细胞生长和转移的重要原因，通过增强癌细胞间的缝隙连接通讯功能，加速细胞间化学物质和化学信息的传递，是某些抗癌药物起效的重要作用机制[18]。Cx是缝隙连接的物质组成基础，其表达可影响细胞间的缝隙连接通讯功能。研究显示，通过对Cx低表达的肿瘤组织重新引入Cx使其恢复原有表达或过表达，均可抑制肿瘤的体外增殖和肿瘤的体内生长[7]，说明Cx与肿瘤关系密切，对肿瘤具有抑制作用。Cx43普遍存在于所有细胞中，是现今研究的热点，很多恶性肿瘤包括黑色素瘤均存在Cx43或缝隙连接通讯下调[19]。已有研究证实，抗癌药物能通过改善肿瘤细胞膜上Cx43的表达量来促进细胞间缝隙连接通讯功能，从而增强药物的肿瘤杀伤效应，并在肿瘤的自杀基因疗法中使自杀基因系统的毒性产物更多地通过缝隙连接通道传导到未转染自杀基因的细胞中，进而增强药物的旁杀伤效应[3]。

本研究结果显示：山奈酚能体外抑制B16细胞增殖，光镜下见山奈酚作用下细胞数量减少、形态变得不规则，且上述作用随着药物作用浓度的升高而增强。细胞接种荧光示踪法显示，经山奈酚处理后的药物组供体细胞旁的接受细胞数目显著增加，且具有量效依赖性，说明药物组细胞间的物质传递功能增强，山奈酚能通过促进B16细胞间缝隙连接通讯功能实现对肿瘤细胞的杀伤效应。Western blotting检测结果显示，山奈酚上调B16细胞Cx43蛋白表达量，且有明显的量效关系，初步揭示了山奈酚促进B16细胞缝隙连接通讯功能的具体机制。

综上所述，山奈酚可抑制小鼠黑素瘤B16细胞增殖，具有明确的抗肿瘤作用；促进Cx43表达和缝隙连接通讯功能可能是其作用机制。

参考文献：

[1] 田红,肖桂芝,田苗,等.黑色素瘤治疗药物的研究进展[J].现代药物与临床,2015,30(7):890-896.

[2] 张艳丽,祝顺琴,刘亚玲,等.恶性黑色素瘤内科治疗研究进展[J].肿瘤防治研究,2014,41(1):74-78.

[3] 张雅雯,邵东燕,师俊玲,等.山奈酚生物功能研究进展[J].生命科学,2017,29(4):400-405.

[4] 周瑶,杜标炎,谭宇蕙,等.山奈酚对大鼠肝癌细胞CBRH7919的增殖抑制及诱导凋亡作用[J].广州中医药大学学报,2010,27(3):250-253,317.

[5] 杜标炎,周瑶,谭宇蕙,等.山奈酚对人胃癌MGC-803细胞的生长抑制及诱导凋亡作用[J].肿瘤,2010,30(6):477-480.

[6] 汪灵芝,彭建新,陶亮,等.缝隙连接蛋白43组成的缝隙连接对依托泊苷抗肿瘤作用的影响[J].中国癌症杂志,2015,25(1):1-5.

[7] 许雅芳,宋丽艳,张章,等.缝隙连接蛋白:肿瘤治疗的新视角[J].中国生化药物杂志,2015,35(10):1-4.

[8] 赵宇,李玉梅,秦叔逵,等.Connexin43在肝细胞癌组织中的表达[J].肿瘤防治研究,2015,42(12):1210-1215.

[9] 张彩霞,江滨,张亚杰,等.间隙连接蛋白Cx43在肿瘤发生发展中作用[J].辽宁中医药大学学报,2017,19(1):147-151.

[10] 郭军.黑色素瘤治疗研究进展[J].科技导报,2014,32(26):15-21.

[11] Ademosun AO, Oboh G, Passamonti S, et al. Inhibition of metalloproteinase and proteasome activities in colon cancer cells by citrus peel extracts[J]. J Basic Clin Physiol Pharmacol, 2015,26(5):471-477.

[12] Jo E, Park SJ, Choi YS, et al. Kaempferol suppresses transforming growth factor-β1-induced epithelial-to-mesenchymal transition and migration of A549 lung cancer cells by inhibiting Akt1-mediated phosphorylation of smad3 at threonine-179[J]. Neoplasia, 2015,17(7):525-537.

[13] Lee GA, Choi KC, Hwang KA. Kaempferol, a phytoestrogen, suppressed triclosan-induced epithelial-mesenchymal transition and metastatic-related behaviors of MCF-7 breast cancer cells[J]. Environ Toxicol Pharmacol, 2017(49):48-57.

[14] Qin Y, Cui W, Yang X, et al. Kaempferol inhibits the growth and metastasis of cholangiocarcinoma in vitro and in vivo[J]. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2016,48(3):238-245.

[15] Adebayo AH, Tan NH, Akindahunsi AA, et al. Anticancer and antiradical scavenging activity of Ageratum conyzoides L. (Asteraceae)[J]. Pharmacogn Mag, 2010,6(21):62-66.

[16] Wu LY, Lu HF, Chou YC, et al. Kaempferol induces DNA damage and inhibits DNA repair associated protein expressions in human promyelocytic leukemia HL-60 cells[J]. Am J Chin Med, 2015,43(2):365-382.

[17] 汤南,万洁,陈博,等.紫杉醇、多西紫杉醇对大鼠肝细胞株BRL-3A细胞缝隙连接功能的影响[J].山东医药,2016,56(23):31-33.

[18] 杜标炎,周瑶,易华,等.六味地黄丸入血成分对自杀基因杀伤肝癌细胞的增效作用[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(16):220-224.

[19] 李玢,张广献,刘娟,等.过表达及定点突变缝隙连接蛋白Cx43小鼠黑色素瘤细胞模型的构建[J].中药新药与临床药理,2014,25(3):373-377.