藤黄酸对非小细胞肺癌A549细胞凋亡及Bcl-2、Bax、P53基因表达的影响

郭晓彤 魏优蕾 雷加吉 李广华 徐广全

(哈尔滨医科大学附属第二医院胸外科，黑龙江 哈尔滨 150001)

非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌的主要病理类型，约占全部肺癌的80%〔1〕。在过去的几十年里，手术、放化疗、新辅助治疗等是肺癌的主要治疗手段，虽然挽救了部分患者的生命，但疗效仍非常有限，其中Ⅲa、Ⅲb及Ⅳ期的NSCLC患者5年生存率仅为19%、7%和2%〔2〕。由此可见，筛选开发新一代高效低毒性的抗肺癌药物意义重大。藤黄酸是中药藤黄的主要成分，既往研究已经证实〔3，4〕其能有效抑制多种(如肝癌、乳腺癌、结直肠癌及前列腺肿瘤等)癌细胞增殖。然而，藤黄酸对NSCLC A549细胞凋亡的影响及机制尚未完全阐明。本研究观察不同浓度的藤黄酸对NSCLC A549细胞凋亡及B淋巴细胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、P53表达的影响。

1 材料和方法

1.1主要材料 A549细胞购自上海信裕生物科技有限公司，藤黄酸(分子式C38H44O8，分子量628.76 D，纯度≥98%)购于成都瑞芬思生物科技有限公司，胎牛血清、F12-K细胞培养基、0.25%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)、磷酸缓冲盐溶液(PBS)等均购自美国Gibco公司，Bcl-2多克隆抗体、Bax多克隆抗体、P53多克隆抗体及PUMA多克隆抗体购于Cell Signaling Technology公司，Annexin V-FITC/PI双染色凋亡细胞检测试剂盒购于碧迪医疗器械(上海)有限公司(BD)，细胞裂解液自行配制，酶标仪为芬兰Labsystems公司，流式细胞仪购于美国Becton Dickinson公司，CO2培养箱购自日本SANYO公司。

1.2方法

1.2.1A549细胞培养、冻存、复苏 A549细胞采用F12-K完全培养基于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中常规培养，待细胞密度达90%左右且生长状态良好时加入0.25%胰酶-0.02% EDTA消化，密切观察，待细胞变圆后加入完全培养基使消化反应停止，常规方法收集细胞悬液，以800 r/min室温离心5 min后采用完全培养基重悬细胞，传代于培养皿中继续培养。当细胞密度达90%左右且生长状态良好时消化(具体方法同上)收集细胞，离心去上清后采用细胞冻存液重悬细胞，重悬的细胞转移至冻存管，在4℃冰箱放置0.5 h后转移至-80℃冰箱保存。实验时取出冻存的细胞，在37℃水浴中复苏，离心去上清后采用完全培养基重悬细胞，重悬的细胞装于培养瓶中，在37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中继续培养。

1.2.2A549细胞凋亡实验 取对数生长期的A549细胞，采用0.25%胰酶-0.02% EDTA消化，离心后收集细胞并采用完全培养基重悬，然后将重悬的细胞置于镜下计数，将细胞浓度调整为1.0×105个/ml，以3 ml/孔的量接种于6孔板，然后将其置于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中继续培养，待细胞融合率达到60%左右时去培养液并采用PBS常规清洗3次，根据实验需求分为空白对照组、藤黄酸2.5、5.0和10.0 μmol/L组，空白对照组加入完全培养基3 ml，藤黄酸2.5、5.0和10.0 μmol/L组加入3 ml含藤黄酸2.5、5.0和10.0 μmol/L的培养基，置于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养24 h，加入0.25%胰酶消化收集细胞，采用PBS按1∶1重悬细胞，取重悬后的单细胞悬液100 μl分装于两支试管，其中一支加入5 μl的Annexin V-FITC，另一只加入10 μl的PI，混匀后将两支试管中的悬液合装，轻震荡混匀后避光孵育15 min，在流式细胞仪检测525 nm波长处V-FITC荧光强度，在流式细胞仪610 nm波长处检测PI荧光强度，采集数据用Flow Jo软件进行处理。

1.2.3MTT检测A549细胞生长情况 细胞制备、收集、铺板等同凋亡实验，接种于96孔板中加入100 μl含5×103个细胞悬浮液继续培养，培养条件同凋亡实验，将50 mmol/L的藤黄酸母液用完全培养基稀释成0.5、1.0、2.5、5.0和10.0 μmol/L的培养液，根据不同的培养液浓度分为0.5、1.0、2.5、5.0和10.0 μmol/L五组，各孔加入100 μl含药培养基，每样浓度设置6个复孔，分别于干预24、48、72 h后加入MTT储存液10 μl，继续培养3 h,1 200 r/min离心5 min，去除上清液后每孔加入150 μl的DMSO并低速震荡10 min使结晶充分溶解，将96孔板置于酶标仪，以490 nm波长检测各孔吸光值，计算细胞存活率。

1.2.4Western印迹实验 取对数生长期的A549细胞用0.25%胰酶消化，离心、收集细胞、细胞重悬及细胞计数方法同凋亡实验，将细胞浓度调整为1.5×105个/ml，接种于60 mm的培养皿，每培养皿中3 ml相当于4.5×105个细胞，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中贴壁过夜，融合率达60%左右时去原培养液，PBS清洗3次，分别加入3 ml完全培养基(空白对照组)和3 ml含藤黄酸2.5、5.0、10.0 μmol/L的培养基，置于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中继续培养24 h，PBS清洗3次，每培养皿中加入200 μl裂解液，刮取细胞集中于裂解液，转移至1.5 ml离心管，充分裂解30 min，12 000 r/min 4℃离心5 min，取上清保存至600 μl离心试管，测定P53蛋白水平及其下游基因Bcl-2、Bax和PUMA的表达水平〔5〕。P53蛋白以750 nm为检测波长，酶标仪读取各孔吸光值，绘制标准曲线，计算样品浓度，Bcl-2、Bax和PUMA基因表达在电泳分离目标蛋白后常规处理，化学发光后采用Quantity One图像分析软件进行分析处理，计算其相对表达量〔6〕。

1.3统计学方法 采用SPSS23.0软件行t检验或方差分析。

2 结 果

2.1藤黄酸对A549细胞凋亡率的影响 干预24 h后，空白对照组A549细胞凋亡率为(7.82±1.34)%，藤黄酸2.5 μmol/L组为(22.46±3.47)%，藤黄酸5.0 μmol/L组为(41.37±6.28)%，藤黄酸10 μmol/L组为(66.67±5.48)%，4组比较差异有统计学意义(P<0.05)。随着藤黄酸浓度的上升，A549细胞凋亡率呈上升趋势，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.2藤黄酸对A549细胞生长情况的影响 采用藤黄酸干预的各组A549细胞的生长均受到一定程度的抑制，且存在剂量、时间关系，不同浓度的藤黄酸干预组A549细胞存活率均低于空白对照组，随着时间的推移，各干预组A549细胞存活率降低(P<0.05)。见表1。

2.3藤黄酸对A549细胞P53、Bcl-2、Bax、PUMA表达水平的影响 干预24 h后，P53、Bax、PUMA的相对表达量随着藤黄酸浓度的增加而增加，且2.5、5.0、10.0 μmol/L组均高于空白对照组(P<0.05)；但Bcl-2的相对表达量随着藤黄酸浓度的增加而降低，且2.5、5.0、10.0 μmol/L组低于空白对照组(P<0.05)。见表2。

表1 不同浓度藤黄酸对A549细胞生长的影响

与空白对照组比较：1)P<0.05；与24 h比较：2)P<0.05

表2 不同浓度藤黄酸对A549细胞P53、Bcl-2、Bax、PUMA表达水平的影响

与空白对照组比较：1)P<0.05；与2.5 μmol/L组比较：2)P<0.05；与5.0 μmol/L组比较：3)P<0.05

3 讨 论

最新流行病学调查显示〔7〕，I期患者约占NSCLC总数的24%，Ⅱ期约占NSCLC总数的11%，而Ⅲ期患者约占NSCLC总数的24%，Ⅳ期的患者约占NSCLC总数的41%。以上数据表明，NSCLC以Ⅲ期和Ⅳ期(即中晚期)为主，而Ⅲ期、Ⅳ期NSCLC患者的5年生存率较低〔1,2〕，由此可见NSCLC的临床治疗仍面临严峻的挑战。以铂类为基础的一线化疗方案的临床疗效已进入平台期，因而迫切需要开发针对NSCLC的新治疗模式及新型药物。与化学合成药物相比，从天然药用植物分离获得抗肿瘤药物具有研发周期短、研发费用较低、毒副作用较小、作用机制广泛等优势。中医认为肺癌最初起于痰浊之邪，痰浊壅肺，肺失宣发肃降，给予清热解毒、活血化瘀类中药可获益〔8,9〕。藤黄酸是中药藤黄的主要活性成分，藤黄是植物藤黄分泌的干燥树脂，性寒味酸、辛、涩，可有效抑制多种肿瘤细胞增殖〔10,11〕。另有研究表明〔12,13〕，有效浓度的藤黄酸不会明显抑制正常造血，是一种具有良好前景的抗肿瘤活性药物成分，但其对NSCLC A549细胞凋亡的影响及机制都尚未阐明，还需进一步研究。

本研究显示，藤黄酸可促进A549细胞凋亡，抑制NSCLC A549细胞增殖，且存在剂量、时间关系。藤黄酸可活化P53蛋白及其下游靶基因Bax、PUMA表达。Bax和PUMA基因均为粗凋亡基因，同时抑制抗凋亡基因Bcl-2基因活化，从而起到促A549细胞凋亡，抗A549细胞增殖的作用。既往研究显示〔14,15〕，中药活性成分抗肿瘤主要通过上调细胞内反应性氧自由基(ROS)含量引起DNA损伤、线粒体通透性改变及粗凋亡内容物释放而实现。而ROS是稳定P53转录活性或表达上调的重要因素，可延长P53蛋白的半衰期、上调P53表达。P53作为转录因子可调控其下游靶基因的表达，Bax、PUMA等促凋亡基因可在P53诱导下表达上调，而抗凋亡基因Bcl-2表达下调，藤黄酸对A549的凋亡作用与其可诱导P53表达有关〔16〕。

综上所述，藤黄酸可能通过增加反应性ROS含量使P53表达水平上调，而P53表达上调可诱导其下游促凋亡基因Bax和PUMA表达上调，抗凋亡基因Bcl-2表达下调，从而促进A549细胞凋亡和抑制A549细胞增殖，其促进A549细胞凋亡存在剂量与疗效的关系，抑制A549细胞凋亡存在剂量、时间与疗效的关系。

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