HBV相关慢加急性肝衰竭患者血清miRNA-130a表达变化及其与病情严重程度和预后的相关性

高飞，尹纪来，李浩，王大平

(海南医学院第一附属医院，海口570102)

慢加急性肝衰竭(Acute-on-chronic liver failure，ACLF)是一种急性肝脏损伤，临床上主要表现为凝血机制障碍、高胆红素血症以及多脏器功能衰竭等。我国90%的ACLF由HBV引发，称为HBV相关慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)。HBV-ACLF患者发病90天内病死率高达43.1%，比其他慢性肝病高15倍，准确评估患者的预后有利于降低病死率[1～4]。终末期肝病模型(Model for end-stage liver disease，MELD)可对终末期肝病短期、中期病死率进行有效的预测，其评分越高，HBV-ACLF患者病情越重、预后越差。微小RNA(miRNA)是调节基因表达的重要因子[5]。研究[6～8]表明，miRNA-130a在机体抗感染过程中，具有抗病毒、抗细菌和加强细胞吞噬的作用。由于血清miRNA-130a检测具有灵敏、准确、快速、简便、重复性好等特点，被广泛应用于多种疾病的诊断、判断疗效及预后[9]。本研究观察了HBV-ACLF患者血清miRNA-130a水平变化及其与病情严重程度和预后的关系。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2011年7月～2014年9月海南医学院第一附属医院收治的HBV-ACLF患者110例为病例组，男55例、女55例，年龄(45.30±9.70)岁，其中早期35例(早期组)、中期60例(中期组)、晚期15例(晚期组)，生存81例(生存组)、死亡29例(死亡组,截至2018年1月1日)。病例组MELD评分为(27.09±8.65)分。纳入标准：符合亚太肝脏研究学会制定的HBV-ACLF诊断标准(2009年第3版)[10]。排除标准：患者有非酒精性脂肪肝、原发性硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、酒精性肝病、Wilson病或恶性肿瘤等疾病。选择同期健康体检者54例为对照组，其中男29例、女25例，年龄(45.5±9.80)岁。病例组、对照组性别、年龄具有可比性(P均>0.05)。所有受检者清晨空腹抽取肘静脉血10 mL，室温静置30 min，3 000 r/min离心10 min，分离血清备检。

1.2 血清miRNA-130a检测 采用mirVana miRNA分离试剂盒(Ambion公司)提取病例组及对照组血清总RNA，Nanodrop 2000分光光度计(Thermo Scientific公司)测量RNA的纯度,参照GenBank数据获取待测基因序列，采用Primer 5.0软件，根据实时荧光定量PCR引物设计原则设计引物。miR-130a正向引物为5′-AGTCTATACAAGGGCAAGCTCTC-3′，反向引物为5′-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3′;内参基因β-actin正向引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反应体系：正向引物0.4μL、反向引物0.4μL、RNA模版0.6 μL、超级酶混合物0.2 μL、RT-qPCR缓冲液5 μL、去RNA水3.4 μL。93 ℃预变性5 min，40个循环(93 ℃ 40 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s)进行PCR扩增。用2-ΔΔCt表示血清miR-130a的相对表达量。

1.3 血清miRNA-130a的表达量与HBV-ACLF患者预后关系分析 对所有HBV-ACLF患者进行随访，随访截止日期为 2018年1月1日或患者死亡，随访内容为治疗效果、恢复情况、病情变化、不良预后结局(肝硬化、腹水、肝肾综合症、上消化道出血、糖尿病、肝性脑病、电解质紊乱、死亡)发生情况等。以HBV-ACLF患者血清miRNA-130a相对表达量中位数为界，将110例HBV-ACLF患者分为miRNA-130a高表达组和低表达组，分析血清miRNA-130a的表达量与HBV-ACLF患者预后的关系。

2 结果

2.1 各组血清miRNA-130a相对表达量比较 病例组、对照组血清miRNA-130a相对表达量分别为9.54±4.76、1.65±0.56，两者相比，P<0.05。HBV-ACLF早期组、中期组、晚期组血清miRNA-130a相对表达量分别为13.01±1.62、9.12±2.04、7.99±2.88，两两相比，P均<0.05。HBV-ACLF死亡组、生存组血清miRNA-130a相对表达量分别为7.87±2.76、10.43±4.20，两者相比，P<0.05。

2.2 病例组患者血清miRNA-130a表达量与MELD评分的相关性 病例组患者血清miRNA-130a表达量与MELD评分呈负相关关系(r=-0.654，P<0.01)。

2.3 病例组血清miRNA-130a表达量与HBV-ACLF患者预后的关系 病例组患者中miRNA-130a低表达组68例、高表达组42例。出现肝硬化、腹水、肝肾综合征、上消化道出血、糖尿病、肝性脑病、电解质紊乱和死亡者miRNA-130a低表达组分别为24、22、17、19、21、16、32、21例，高表达组分别为3、5、4、3、5、3、3、8例，两组相比，P均<0.01。

3 讨论

动物及细胞学试验[11]证明，miR-130a参与了由多种病因引起的肝损伤或肝衰竭的发病过程。miR-130a可能是大鼠肝脏热缺血和再灌注损伤的潜在生物学标志物，在肝脏再灌注损伤后，升高的miR-130a与丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶和乳酸脱氢酶呈正相关[12]。在对乙酰氨基酚诱导猪急性肝衰竭的试验[13]中，miR-130a表达水平上升显著，且与肌酐升高呈正相关。本研究结果显示，病例组miRNA-130a表达水平显著高于对照组，这与上述结果一致。

研究[14]表明，miRNA-130a可调控淋巴细胞的定向转移和趋化性，并可激活淋巴细胞、内皮细胞、中性粒细胞、上皮细胞的趋化因子受体。在大鼠肝衰竭试验[15]中，miRNA-130a抑制淋巴细胞、巨噬细胞凋亡，并诱导淋巴细胞、巨噬细胞从脾脏向肝脏的转移，参与炎症反应。miRNA-130a还参与调节中性粒细胞的有丝分裂，降低有丝分裂停滞蛋白的表达，并可加强抗炎药物定向攻击病变细胞；miRNA-130a还能促进淋巴细胞与肝脏病变组织黏附结合，建立反应灶。这些研究结果提示，在肝衰竭的发病过程中，miRNA-130a高表达提示机体的免疫反应增强，可能会为肝衰竭患者带来良好的预后。结合本研究结果，HBV-ACLF中期组、晚期组miRNA-130a相对表达量低于早期组，晚期组miRNA-130a相对表达量低于中期组，HBV-ACLF死亡组miRNA-130a相对表达量低于生存组，显示随着HBV-ACLF患者病情严重程度的增加，miRNA-130a相对表达量逐渐降低。

研究[16～18]表明，miRNA-130a提高肝衰竭患者预后与一系列调控机制有关：miRNA-130a能通过碱基互补配对与目标RNA的编码区特异性结合，促进RNA的翻译，促进淋巴细胞锚定融合血管内壁，促进免疫细胞束缚病变靶细胞，而一些细胞免疫活性因子如MCP-1、TNF-a、IL-1、IL-8等与miRNA-130a表达正相关。相关性分析结果显示，miRNA-130a与MELD呈负相关关系，这提示miRNA-130a表达量与HBV-ACLF患者病情严重程度和预后负相关。为验证上述结论，我们以HBV-ACLF患者血清miRNA-130a相对表达量中位数为界，将HBV-ACLF患者分为miRNA-130a高表达组和低表达组，结果发现miRNA-130a低表达组HBV-ACLF患者肝硬化、腹水、肝肾综合症、上消化道出血、糖尿病、肝性脑病、电解质紊乱、死亡发生率高于miRNA-130a高表达组HBV-ACLF患者，这证实了上述结论，同时也说明高表达的miRNA-130a能提高HBV-ACLF患者预后。

综上所述，HBV-ACLF患者miRNA-130a相对表达量显著升高，且随着HBV-ACLF患者病情严重程度的增加，miRNA-130a表达量逐渐降低。高表达的miRNA-130a能提高HBV-ACLF患者预后。